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基于LAMP技术mecA/ nuc /femB三基因联合MRSA快速检测方法的建立
一、研究背景
二、LAMP技术
三、技术路线
四、前期工作及预期结果
研究背景
研究背景
MRSA分离率逐年增加
研究背景
研究背景
Diekema DJ,et al.Clin Infect Dis.2001;32:S114-32
全球MRSA流行现状
中国CHINET(2010)
研究背景
研究背景
MRSA
VRSA
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resisitant staphylococcus aureus, MRSA)指含有mecA基因或者苯唑西林最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)≥2μg的金黄色葡萄球菌菌株。
MRSA的进化历程
90 to 95% of current S. aureus strains are resistant to penicillin
About 60 to 70% of strains are resistant to methicillin
Two cases of vancomycin-resistant S. aureus were reported.
研究背景
MRSA耐药机制
※药物作用靶位的改变
※药物灭活酶的产生
※细胞壁通透性改变
※主动外排泵的作用
研究背景
※手术之前进行MRSA筛选可以显著减少手术部位MRSA感染风险
筛查可降低MRSA感染率
※住院病人MRSA筛选可以显著减少MRSA的感染与传播
病原菌鉴定方法的比较
头孢西丁纸片法
微量肉汤稀释法
E-test实验
MRSA主要检测方法
PCR法
荧光定量PCR法
环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification ,LAMP)是2000年Notomi 等建立的一种新型体外特异扩增DNA 片段的分子生物学技术。
LAMP 技术
LAMP 技术的原理
目的基因
部分产物结构
62-65度等温反应
最多1小时即可获得特异的结果
LAMP 反应条件及结果
LAMP 技术的优点
※灵敏度高
※特异性强
※反应时间短
※所需设备简单
※产物检测快捷
LAMP法与PCR法的比较
靶基因的选择
mecA:编码PBP2α蛋白,是MRSA 耐药的定性决定性因素;PCR法检测mecA被认为是检测甲氧西林耐药的“金标准”;
nuc :编码细胞外耐热核酸酶,是葡萄球菌属所特有的保守性基因,检测nuc基因可以有效的区分葡萄球菌属和其它菌属;
femB:是甲氧西林耐药的必须因子,影响mecA基因的表达,在金黄色葡萄球菌中高度保守,并且凝固酶阴性葡萄球菌不表达该基因。
技术路线
一、通过查阅文献获取LAMP法mecA引物序列;
二、通过与军事医学科学院基础医学研究所查磊博士合作利用BIOSUN软件针对nuc和femB基因各设计3对引物,已送公司合成;
三、以我国自主研制、经SFDA批准的MRSA检测试剂盒作为常规标本中MRSA的筛选(已向医院递交新业务开展报告);
前期工作
前期工作
四、对我院2011年MRSA及其它耐药菌进行统计和分析并保留菌株;
五、实验相关试剂的调研。
预期结果
建立一种基于LAMP技术的MRSA快速检测方法
获得适用于LAMP技术的nuc、femB的引物组合
对适用于LAMP技术的nuc、femB扩增区申请专利进行保护
撰写高质量学术论文2-3篇
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