凋亡检测实验精讲.pptVIP

  凋亡检测 ——DNA LADDER—— 主 要 内 容 DNA Ladder 实验 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果 实验原理 细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活. 此酶可作用于连接DNA的核小体间区域, DNA链被切割成180~200bp或其整倍数的片断. 抽提DNA, 经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱 endonuclease Gel electrophoresis 700 520 360 180 Base pairs Distance between cuts = mutiple of 180 bps 180 bps Apoptotic DNA Ladder Lane 1: Marker Lane 2: negative control Lane 3: DNA of apoptotic cells Lane 4: DNA of necrosis cells 金标准 实验步骤 获取凋亡细胞 抽提DNA 琼脂糖凝胶电泳 实验步骤 取16g大小的小白鼠, 外科手术取胸腺 少许洗去血迹 放入研磨器中(160目)研磨, 边磨边加1640液, 获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯, 加入120ml 1640液(一般一只小白鼠可获2x106/ml 细胞) 每孔加入1.2ml DEX(5mg/ml)混匀, co2培养箱, 370c, 5h 取1ml混悬液, 加入24孔培养板中 将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中, 3000rpm, 5min, 去上清, 加入70%乙醇700ml混匀.震荡打散细胞,-200c固定过夜 离心， 3000rpm， 5min, 去上清（不要回倒， 棉棒沾干液体，勿触及沉淀） 加入氯仿，剧烈震荡，离心12000rpm， 10min 加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k, 混匀， 600c水浴，30-45min 100ul饱和Nacl, 来回颠倒混匀，4度15min 将上清转入无水乙醇管，颠倒离心管数次可见白色絮状物（DNA） 离心12,000 rpm，5min，弃上清，用棉签吸干残留的无水乙醇 析出的DNA应成小白点状沉淀于管底，如贴附于管壁，加溶解液时应小心 取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析 加入50ul溶解液至管中，反复吸打数次至DNA溶解 电泳100v,1h 吸出50ul已溶解的凋亡细胞DNA，加入到2%琼脂糖凝胶孔电泳 1. 取出胸腺后, 一定要注意将组织去除干净。 2. 样本须先经70%乙醇固定,以防止DNA降解。 3. 70%乙醇, 无水乙醇应-200c预冷。 4．氯仿抽提蛋白时，应用振荡器剧烈振荡，吸移上清时，注意不要将蛋白质层吸动时（宁少勿多，以免蛋白质污染） 5．可根据DNA量的多少加样。 6. 用2% agrose电泳可获较佳分离效果。 注意事项 实验结果