分子生物学实验指导学案.doc

分子生物学实验指导 动物医学、动植物检疫专业 2015，9 分子生物学实验注意事项 ? 1．?课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。 2．?由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。 3．?实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。 4．?实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！ 5．?对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。 6．?写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。 7．?在实验室内不能大声喧哗。 8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。 9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。 10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。 11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。 ? 实验一 质粒DNA的提取 1．目的 学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。 2．原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0(12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 3．器材 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。 4．试剂 pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。 5．实验准备 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20(C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200(L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121(C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20(C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121(C 30min）。 6．操作步骤 （1）?在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。 （2） 从超低温冰箱中取出保存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37(C摇床中摇20h。 （3）??取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。 （4）??在沉淀中加入100(l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。） （5）?加入200(l 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 （6）加入150(l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 （7）?15000rpm离心5min，小心吸取400(l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加