05第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产(一)概述.pptxVIP

第五章 植物细胞培养及次生代谢产物的生产（一） 红河学院 生命科学与技术学院 陶宏征 三个问题 什么是细胞培养？ 如何进行细胞培养？ 细胞培养的应用（生产次生代谢产物）？ 植物细胞培养定义 植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术 植物细胞培养的应用 1. 研究植物细胞的特性和潜力 2. 了解细胞间的相互关系 3. 研究细胞分化发育和形态发生的分子机理 4. 进行细胞代谢研究及各种不同物质对细胞影响的研究 5. 用单细胞克隆技术，建立某些优良特征的单细胞无性系 6. 采用生物化学方法，结合基因工程技术，诱发突变体产生或建立遗传转化系 7. 利用生物反应器大规模培养细胞进行次生代谢产物生产 植物细胞培养与其他细胞培养的区别 植物细胞直径一般约10-200微米，平均直径比微生物细胞大30-100倍。 植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相细胞团方式存在。 植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。 与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月 植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难 植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。 植物细胞培养的方法 1. 按培养规模：小规模培养和大规模培养 2. 按培养方式：平板培养法、悬浮培养、看护培养、 微室培养等； 3. 按培养基类型：固体培养和液体培养 4. 按要求产物:用于诱变细胞培养和生产次生产物的细胞培养。 细胞培养常用仪器 第一节 单细胞分离及培养技术 一、单细胞分离的方法 （一）机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。 优点：细胞不受酶伤害。 缺点：只适合于排列松散的薄壁细胞、效率低、产量少。 1969年，Gnanam和Kulandaivelu用该方法分离出几种成熟叶片叶肉细胞。 第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：叶片研碎、离心 （二）酶解法： 指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。 优点：最有效的一种方法。 缺点：成本较高，酶对细胞有一定伤害。 1968年，Takebe等用该方法分离烟草叶肉细胞成功 机械法和酶解法比较 机械法 酶解法 细胞不受到酶的伤害； 不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破。 细胞受到酶的伤害； 要质壁分离； 细胞产量高； 细胞不易破。 （三）愈伤组织诱导法： 指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。添加生长素或酶。 外植体 连续继代培养愈伤组织 筛选未分化和易散碎的愈伤组织 振荡培养 过滤和离心 理想的细胞悬浮液 建立单细胞悬浮液的程序 诱导和筛选愈伤组织 促使细胞游离，获得单细胞 建立悬浮细胞培养系 二、单细胞培养技术 （一）平板培养法 　　指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。 　　　此法是Bergman (贝格曼，1960) 首创。平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。 1. 步骤 　　? 制备单细胞悬浮液 　　? 调制悬浮培养液中的细胞密度 　　? 倾倒平板(植板) 　　? 密封、标记和培养 2. 优劣 平板培养法的优点在于单细胞在培养基中分布较为均匀，也便于定点观察，缺点是容易造成培养细胞的通气不良。 3.植板率 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 植板率＝每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总×100% （二）看护培养与饲养层培养法 1. 看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。 谬尔（Muir，1953）首创此法。该方法的优点是简便易行，效果好。但不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。 2. 饲养层培养：是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。饲养层培养具体方法有四种：① 饲养细胞与靶细胞混合。② 前者位于下层，后者相反。③ 一起培养于液体培养基中。④ 双层滤纸植板培养 （三）液体浅层静置培养法 指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。 该方法优点：易于补加新鲜培养基，便于镜检。 （四）细胞悬浮培养法 指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。 优点： ① 能大量提供比较