06第六章原生质体培养和体细胞杂交概述.pptx

第六章 原生质体培养和体细胞杂交 红河学院 生命科学与技术学院 陶宏征 三个问题 1 . 什么是植物的原生质体？ 2. 为什么要培养植物的原生质体？ 3. 怎样进行植物的原生质体培养？ 4. 什么是体细胞杂交？ 5. 为什么要进行体细胞杂交？ 6. 怎样进行体细胞杂交？ 什么是植物原生质体？ 植物原生质体（protoplast）是去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的细胞 是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料 仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动 是植物遗传转化的理想受体 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、细胞核、甚至 病毒颗粒等 原生质体 第一节 原生质体的分离与纯化 一、材料的选择 1. 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 2. 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体 3. 叶片是最常用的材料 4. 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系分离原生质体效果较好 5.一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材料 二、材料的预处理 (1)暗处理 在分离原生质体前,将在温室内生长5-7周的豌豆枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1-2天。获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。 (2)预培养 把羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于又到愈伤组织的培养基上预培养7天，然后再用酶液脱壁。 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组，但培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织 (3)预萎蔫 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。 (4)预质壁分离 把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后再放入酶液去壁。加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。 三、分离方法 （一） 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 （二）酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。 酶解分离法 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力 酶解分离法 酶液的配制 使用原则：以用最少的酶制剂种类、最少的量，但能分离得到完整、健康的原生质体为准 使用前需要对酶进行纯化 在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性，一般渗透稳定剂浓度为0.35-0.8mol/L 适宜PH：5.4-6.0范围 常用的渗透稳定剂 1、糖醇和可溶性糖：包括甘露醇（常用）、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等 2、无机盐：CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培养基中的无机盐组成 稳定剂中附加钙盐（0.1%）可以增强质膜稳定性；葡聚糖硫酸钾（0.5%-1%）能抑制酶液内某些杂酶和RNA酶的活性，也有助于质膜稳定；加入少量AgNO3能减少酶解时产生的乙烯；加入过氧化氢歧化酶以减轻O2ˉ自由基对细胞膜的损伤，从而提高原生质体的植板率 （3）分离原生质体 ①两步分离法（顺序法）： 先用果胶酶使细胞分离，再用纤维素酶解离细胞壁获得原生质体 ②一步分离法（直接法）： 把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理，目前多用。 分离需注意： 材料和酶液的体积比： 1:10 温度：25-30℃ 黑暗或弱光条件 一般静置进行，每隔一段时间轻轻摇动几下，也可将培养皿一直放在50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原生质体 （4）原生质体的纯化 ①离心沉淀法（沉降法） 步骤： 将收集的含有原生质体和酶液的滤液低速离心 经离心后，原生质体沉降与管底，上部为含碎片的混合液。弃去含杂质的上悬液，重新悬浮原生质体，再次离心，如此重复3次 用原生质体培养基洗涤一次，收集管底纯净的原生质体，用培养基调整到一定密度后进行培养 优点：操作简便 缺点：在制备过程中易造成原生质体的损伤，而且纯度不够好，常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体 ②漂浮法 滤液 原生质体漂浮于溶液表面，杂 质下沉到