蛋白质工程第四讲 分离纯化与分析.pptVIP

第四讲 分离纯化与分析 一、分离纯化是分析的重要过程： 针对分析目的不同，对分析对象的要求和采取的措施不同。 若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：抗原及其抗体检测，配体及其配基等。 多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、动力学（变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分析。 为了保证分析的准确度，避免检测体系中某些物质的干扰，往往对样品进行处理。 二、分离分析的含义： 1、分离过程本身可以是分析过程 样品干扰严重，需通过分离再检查， 分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC） 2、分离过程的分析——优化纯化工艺 分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等 3、基本要求： 客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。 4、分析方法要求： 选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等 三、如何理解分离纯化与分析（三个层次） 物质的分析离不开分离： 分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析； 物质分离纯化过程离不开分析检测： 分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。 分离纯化过程即是分析检测过程： 电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等； 分析是对事物的感知，是眼睛、是手段 2、膜分离： 膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析 膜材料和特性： 有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等） 陶瓷膜：陶瓷材料 膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等 应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，膜生物反应器。 3、萃取： 4、离心： 分类：低速离心、高速离心、超速离心 分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度） 5、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等 6、联用方法：膜过滤-盐析—等电点，离心—萃取，离心-盐析—等电点等等 B：精制分离—色谱分离： （A）精制过程，纯度较高 （B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为平推流。 （1）吸附分离技术：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附剂）—流动相（洗脱剂）分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程（固相和流动相之间连续分配的过程） 吸附剂：吸附剂的选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。 吸附剂的选择：根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离对象，选择极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂的选择依靠经验和多次试验。 吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等 柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。 薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析 硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)， 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化测定（约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯做展层剂，Rf大小苏丹黄苏丹红.靛酚蓝，苏丹黄Rf）0.5，苏丹红和靛酚蓝Rf之差在0.1—0.2)。 分析程序：点样，展层，显色。 TLC 色素指纹图谱和灰度分析 聚酰胺薄膜薄层层析： DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）， 灵敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。 DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。 Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10 nmol肽样品）。 （2）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离 原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的分配系数不同，将分子分离。排阻的范围为0—100%。 分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。 Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo) Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分别为床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。 分离物质的大小，0 Kav 1， Kav=0或Kav=1，不能分离。 常用介质： 交联葡聚糖（Sephadex G10—G200）； Amersham Biosciences 交联琼脂糖（