镧系元素和二酮结合于蛋白质标记来检测蛋白质.docVIP

利用铕-β-二酮类螯合物与蛋白质共价结合的圆偏振发光 指纹识别蛋白质 用圆偏振发光指纹识别 被β-二酮配体标记的金色葡萄球菌核酸酶（SNase）、牛血清蛋白（BSA）、胰岛素（Ins），SNase与BSA和Ins相比表现出反的圆偏振发光特性。 利用荧光识别蛋白质表现出的特殊性质来同步选择性识别不同类型的蛋白质，探针分子和蛋白质的结合表现出蛋白质的指纹发射图像轮廓；镧系元素的圆偏振发光（CPL）特性在这个领域应用很广。因为CPL探测能够很好的区分发射的左、右圆偏振发光之间发射光线的不同，并且还可以将几条线区分为不同的级别。CPL（圆偏振发光）正、反（正、负）的信号结合，能很好的将很窄的狭缝分裂开，这种独特的光学特性能够扩大稀土元素化合物探针检测蛋白质的检测范围。 因此，我们报道了镧系元素的圆偏振发光指纹识别三种蛋白质，即：被Eu(III)-β-二酮类化合物共价结合标记的 牛血清蛋白（BSA）、金色葡萄球菌核酸酶（SNase）和牛胰岛素（Ins）。在许多的探针中，β-二酮类探针由于它与镧系元素离子之间有高效的能量转移和很高的量子产率而得到发展。由于金色葡萄球菌核酸酶被研发并作为一种典型的蛋白质模型用于折叠或伸展研究149号氨基酸， 其发射比率也可以利用金色葡萄球菌核酸酶的热敏延伸来读出并进行研究。研究蛋白质共价震动的发射图像对生物现象的研究很有帮助，并很有前景。 Β-二酮配体包含有一个丁二酰亚胺酯基团（DK）和一个与蛋白质相互反应的小基团，它能从丁二酰亚胺酯的配体和蛋白质中赖氨酸的残留 氨基得到反应，在蛋白质中产生氨基化合物团体（Scheme 1 first step）。利用质谱仪在蛋白质中检测二酰亚胺酯基团配体，和被标记的DK在蛋白质中产生一个整体的大量转变，这与被标记的DK的数量是一致的。利用丁二酰亚胺酯基团（DK）标记 (vide infra)的金色葡萄球菌核酸酶（SNase）在分子量为17.19时 产生大量的峰(Fig. 1b)，这与没有标记的SNase(16.80)相比，蛋白质发生了+0.39的转变（Fig. 1a）。这种转变来自于SNase中残留的赖氨酸氨基与DK探针的结合即（SNase-DK）。由于每个DK标记的赖氨酸在384基团上的增加，与没有标记的BSA(Fig. 1c)相比 被标记的BSA产生了+1.5的转变(Fig. 1d)。 在波长为360nm光的激发下，用DK标记的蛋白质表现出很尖锐的发射峰，在EuCl3反应中，Eu3+离子分别发生了5D0→7F1和5D0→7F2的电子跃迁(Scheme 1 second step），被DK标记的蛋白质与Eu3+之间的结合常数listed in Table 1，这是由滴定曲线得出的(see ESI,? S2)，。。为了确认DK标记的蛋白质与Eu3+之间的共价标记，我们对标记的蛋白质进行了凝胶电泳测试；在紫外光照射下BSA-（DK-Eu3+）和SNase-(DK-Eu3+)表现出很强的红色发射 (Fig. 2e, E and F,respectively)。其分子质量分别于获得的质谱数据非常的相近，（17.19，67.9）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳很清楚的证明了DK-Eu3+标记的蛋白质移动是由于DK-Eu3+与蛋白质标记后产生了很好的共价结合。胰岛素包含了一个残留的赖氨酸，这个氨基酸同样被DK-Eu3+标记，并产生和SNase,BSA同样的效果。 N-羟基丁二酰亚胺； Scheme 1: SNase被DK-Eu3+标记的原理图；Eu3+空的位置被其他的配体占据（如：溶剂分子水，占据了半圆形的位置）。 Fig 1. 正离子基团的质谱： （a） SNase金色葡萄球菌核酸酶；（b） SNase-DK;（c） BSA牛血清蛋白；（d） BSA-DK;（e） 凝胶电泳分析，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳； （A）BSA，（B）SNase,（C）BSA-(DK-Eu3+) 4,Eu3+=24uM,（D）SNase-(DK-Eu3+),Eu3+=3.3uM,;（G）SNase,（H）BSA,（I）SNase 分别在Eu3+为5uM的溶液中；（J）BSA在Eu3+为5uM的离子中；（E）BSA-(DK-Eu3+)4,Eu3+=24uM, （F）SNase-(DK-Eu3+),Eu3+=3.3uM,，，E和F分别是在蛋白质浓度为3.0uM浓度下有紫外可见光激发的。 Table 1. 结合常数K；发射量子产率Φ， 5D0→7F1和5D0→7F2的磁偶极子和电偶极子的非对称因子glum, τobs蛋白质和Lys（赖氨酸）被DK-Eu3+标记后的发射寿命； a,取决于在水溶液中经过校准的球状体系；b,圆偏振信号取决于