2.1基因工程基础解说.pptVIP

PCR反应过程： 预变性：94-95℃，5min 变性：94℃，30s-1min 复性（退火）：38-65℃，30s-1min 延伸：72℃，1-2min 终延伸：72℃，8-10min 循环 （三）PCR反应体系 模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP 蒸馏水（双蒸水或三蒸水） 1、模板：单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 反应缓冲液 2、引物 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 3、Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l，酶量过多使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 4、 dNTP 四种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 5、 Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般存在于反应缓冲液里。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 6、循环参数 a、变性：使双链DNA解链为单链， 94oC 30s~1min b、退火：38~65oC 30s~1min 温度由引物长度和GC含量决定。 引物长度≤20bp时：退火温度=4(G+C)+2(A+T)-5 c、延伸 延伸时间由扩增片段长度决定，一般每延伸1000bp需要1min， 72oC，1~2min。 d、循环次数 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加 94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃ 5 min 30sec 30sec 60 sec 10 min 30 cycle 5.0 μl 10×反应缓冲液 4.0 μl dNTPs 1.0 μl 引物 1 1.0 μl 引物 2 2.0 μl 模版 0.5 μl Taq DNA 聚合酶 36.5 μl 双蒸水 举例： 50 μl 体系： PCR 仪 （四）PCR引物设计 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计的一般原则： 1、引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 2、避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 发卡结构 3、G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 4、要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 5、引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 6、引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。 7、引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 Upstream primer vs Downstream primer Sense primer vs Antisense primer Primer1 vs Primer2 Forward primer vs Reverse primer 简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异，这样的混合引物称简并引物。 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间，增加扩增产物的特异性。 套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 常用的引物设计软件 Oligo 6 Primer Premier 5.0 Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3? 反向PCR 　 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT-PCR 　　　 重组PCR 差异显示PCR