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神经系统电生理学实验方法 陈 蕾 南京医科大学 生理学系 静息电位(resting potential，RP)： 指细胞在未受刺激时存在 于细胞膜内外两侧的电位差。 动作电位 动作电位（action potential，AP）：可兴奋细胞受到适当刺激，受刺激处的细胞膜两侧出现一次快速而可逆的电位变化，称为～ 神经元之间的信息传递—经典的化学突触（主要） 突触兴奋的传递过程 长时程 (long-term) 突触可塑性 动作电位在突触后神经元的产生 实验结果 （二）离体记录：脑片场电位记录 在脑片上，神经组织的三维结构相对完整，含有一些特殊的突触联系，易于作通路刺激。 刺激某些突触联系的突触前纤维，在突触后神经元上可以记录到相应的膜电位改变。 记录电极所记录到的是在其附近一群细胞的膜电位改变的总和。 例如，制备海马脑片，刺激Schaffer侧枝，在海马的CA1区锥体细胞层可以记录到场电位，在辐射层可以记录到兴奋性突触后电位。 基本步骤： 制备海马脑片： 成年大/小鼠经乙醚麻醉后快速断头取脑，置于0-4 ℃冰冻人工脑脊液中1 min备用。→鼠脑稍加修饰后移至振动切片机浴槽内，在0-4 ℃ 人工脑脊液中切取包含海马的冠状脑片3-6片（厚度350 μm）。 →将切好的脑片迅速转移至持续通混合气的氧饱和人工脑脊液中，在28 ℃左右孵育至少60 min后移至记录浴槽。 A B C A:海马立体结构图 B:尼氏染色后的海马冠状切片 C:海马脑片刺激、记录电极放置模式图 （二）离体记录：细胞膜片钳记录 1976年由德国马普生物物理化学研究所的Neher和Sakama首次报道了应用膜片钳技术在蛙胸皮肌细胞膜上记录到单通道电流。膜片钳技术是研究离子通道的“金标准”，应用该技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。 膜片钳技术简介 1950s: Hodgkin和Huxley建立了细胞内微电极电压钳技术，并在神经轴突上测到离子通道电流，提出了离子通道的概念，阐明了动作电位的离子基础。 1963: Hodgkin 和Huxley由于在电生理和电压钳技术的贡献被授予Nobel生理和医学奖 。 1976: Neher 和 Sakman在单个蛙骨骼肌纤维上首次用膜片钳技术记录到单通道离子通道电流，1981年对该技术进行了改进，用负压建立GΩ封接。 1991: Neher和Sakmann因为该技术获得Nobel生理和医学奖。 膜片钳术的基本原理 膜片钳技术是用微玻管电极（尖端直径约1～5 μm）接触细胞膜而不刺入，然后在微电极另一端开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸人电极尖端的纤细开口，这样在这小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，在理想的情况下其电阻可达数个或数十个千兆欧姆以上的高阻抗封接，使与电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜在电学上完全分隔，如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白质分子，那么通过此微电极就可测出单一通道开放时的离子电流和电导，并能对单通道的其他功能特性进行分析。 几种膜片钳记录模式 膜片钳记录中细胞的来源： 急性分离 细胞培养 脑片 急性分离的海马神经元 培养的三叉神经节神经元 海马脑片的锥体神经元 膜片钳可以记录 1.离子通道（细胞） 2.突触传递（脑片） 3.动作电位 疼痛产生的一般过程 伤害性刺激作用于外周感受器(伤害性感受器)换能后转变成神经冲动(伤害性信息)，循相应的感觉传人通路(伤害性传人通路)进人中枢神经系统，经脊髓、脑干、间脑中继后直到大脑边缘系统和大脑皮质，通过各级中枢整合后产生疼痛感觉和疼痛反应。 三、与疼痛有关的电生理实验方法 痛觉调制的机制 外周机制 中枢机制 －伤害感受器 离子通道功能状态、数目 炎性介质 －可塑性改变 兴奋性突触传递增强 抑制型突触传递减弱 与痛觉有关神经递质的调控 高位中枢的调控 痛觉研究中常用的细胞：背根神经节神经元、三叉神经节神经元 应用膜片钳技术可以研究伤害感受器（背根神经节神经元、三叉神经节神经元）的兴奋性 三叉神经节神经元上记录到的四种动作电位 分析动作电位的形态 研究动作电位的数目 应用膜片钳技术可以研究伤害感受器离子通道的功能状态 电压门控性离子通道 配体门控性离子通道: TRPV1, ATP… Na: TTX-S (Nav1.1, 1.2, 1.3, 1.6, 1.7), TTX-R (Nav1.5, 1.8, 1.9) K: IK (Kv1.2) IA (Kv1.4) Ca: HVA (L- Cav1.3, N-Cav2.2,