原位杂交原理解答.ppt

原 位 杂 交 原理 原位杂交技术是分子生物学和组织化学成功结合的产物。 是以特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行原位检测的方法（in situ hybridization）。 基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 应 用 于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究中，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律、肿瘤发生机制及病原微生物的检测，有广泛的应用前景。如： （1）用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位； （2）与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平； （3）用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以确定有无该病原体的感染等。 优 点 （1）能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便； （2）由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 分 类 根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交； 根据其所用探针及所要检测核酸的不同可分为 DNA---DNA杂交 RNA---DNA杂交 RNA---RNA杂交 试 剂 TNE: 50mmol/L Tris-HCl,pH7.4,10mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA 20×SSC: 3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调) 2×SSC: 17.53g NaCl，8.82g柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调)，定容至1L 杂交液: 4×SSC,50%甲酰胺，1×Denhardt’s，5%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml鲑精DNA BufferI: 0.1mol/L Tris-HCl,pH7.5,0.15mol/L NaCl BufferII: 0.5% Blocking agent,BufferI BufferIII: 0.1mol/L Tris-HCl,pH9.5,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2 BufferIV: 10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA 显色液：4.5μl NBT + 3.5μl X-phosphate + 1ml BufferIII ? 方 法 1. 取材 2. 固定 3. 脱水和包埋（按常规组织切片技术操作） 4. 切片 5. 杂交 6. 冲洗与显色 7. 终止显色与复染 8 . 封片 9. 观察与拍照 ? 固 定 现场取濒死斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’s AFA固定液全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成2部分，再置Davidson’s AFA固定液中固定24h ，转入70%乙醇中保存。 组织块(V) ：固定液(V)= 1 ：30 Davidson’s AFA固定液配方（1升）： 95％乙醇 330 ml 福尔马林（37％～39％甲醛水溶液） 220 ml 冰醋酸 115 ml H2O 335 ml 混匀后封口，室温放置。 脱水和包埋（按常规组织切片技术操作） 切 片 ① 载玻片和盖玻片的准备： 3% HCl + 95%乙醇泡30min以上，擦干备用。 硅化载玻片： 2% APES于丙酮中 2min 丙酮 1min dH2O