分子生物学实验方案.docVIP

请你为从某种生物中获得某个基因设计一实验方案 方案的基本路线 方案的可行性分析 如何执行你设计的方案，你需要作何准备 基本路线： 目前获得目的基因的途径有以下三种：一是在未知序列的情况下建立基因组文库或cDNA文库，从中筛选出目的基因的克隆；二是在目的基因序列已知的情况下，可以用化学方法或酶法合成，或者通过合成引物，用PCR由模板扩增获得；三是通过鸟枪法或差异显示和RT-PCR等方法获得。 首先先了解一下与实验相关的一些原理 1.PCR技术的基本原理： 首先使双链的DNA分子变性为单链DNA分子 然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生DNA 互补链。 DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动新链的合成。因此新合成的DNA链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。 2.琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度的原理 在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。 3. 使用TaqDNA聚合酶的理由 Klenow片段热敏感，易失活；反应温度低，出现错配碱基 1986年，从75度的热泉中的细菌中分离纯化出Taq酶。 与大肠杆菌DNA聚合酶相比，Taq酶使PCR的特异性和敏感性高 我打算采取利用引物进行模板扩增来获得目的基因，这也是实验室里最常采用的方法。 首先第一步是设计引物。阅读相关文献，可以采用别人已经设计好并研究出结果的引物，或者利用软件自行设计。 提取DNA，查阅文献确定好提取的方法，并设计好实验步骤。用琼脂糖凝胶电泳的方法检测DNA纯度，若达不到要求，则重复提取步骤。 进行PCR扩增。采取25μL体系，根据实际情况配制多管反应体系，放入PCR仪器中进行PCR扩增。 再次利用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行纯度的检测。 在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链都可以作为合成新生互补链的模板。 在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新旧链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA合成和链的分离。 PCR反应的最后结果是，经过几次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的拷贝数2n. 可行性分析： 已经有大量的实验证实这样的方案是可行的，并且这个方案实验室的设备、试剂等条件是满足的，是可以完成整个实验操作的，具有实际意义。 实验准备： 首先阅读文献设计好引物、设计好PCR反应条件。 列出实验所需要的试剂和仪器，并提前配制好实验所需要的试剂、对实验用品进行灭菌操作并准备好灭菌双蒸水。试剂药品包括EDTA、硼酸等（用于配置TBE作为电极缓冲液），还需要购买琼脂粉、TaqDNA聚合酶等药品。 1