- 1、本文档共40页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
荧光实时定量PCR
4
基本概念
化学原理
1
2
3
等位基因鉴定原理
数学原理
PCR
典型的PCR四阶段
实时荧光定量PCR
PCR扩增反应中
对每一个循环产物荧光信号的实时检测
实现对起始模板定量和定性分析
在实时荧光定量PCR反应中,引入一种荧光化学物质,
随着PCR反应的进行,产物不断积累,荧光信号强度也等比增加。
通过检测荧光强度的变化,我们就可以得到荧光扩增曲线
Real-time PCR VS PCR
1.荧光染料掺入的原理?
——荧光强度与模板的数量成正比
2.如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析?
荧光实时定量PCR技术的产生
1992年由Higuchi等人第一次报告:使用EB加入PCR反应体系,经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度
核酸 ? 染料荧光
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代 EB.
荧光探针杂交技术
两种定量化学
染料染色
SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料
PCR过程中染料的掺入:信号强度与双链DNA分子数正比
扩增曲线
存在的问题
引物扩增的是否是单一的目的基因?
通过扩增曲线进行目的基因的定量分析
检验方法:熔解曲线
熔解曲线
PCR过程中,可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec)
dsDNA解链成为ssDNA
SYBR Green I被释放,荧光信号消失
对熔解曲线求一阶导数,峰值代表斜率改变最大值,即Tm
Tm值:50%DNA变成单链时的温度,此温度与双链DNA的长度、GC含量有关,可部分代表序列的特异性
熔解曲线
染料的特点
探针标记
Taqman探针
一种寡核苷酸探针,它的荧光与目的序列的扩增有关。
探针5’端连接荧光基团,3’端连接淬灭基团。
利用了PCR延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性,
使荧光基团和淬灭基团分离。
热变性,配对
聚合酶,延伸
信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
荧光共振能量转移(FRET)
Oligo 1: Fluorescein
Oligo 2: LC Red 640
10nm
探针的特点
方法
优点
缺点
适用范围
SYBR Green I 方法
适用性广
灵敏
方便
便宜
引物要求高
易出现非特异性带
不能进行多重定量
适合科研中对各种目的基因定量分析,基因表达量的研究,转基因重组动植物的研究
TaqMan 方法
特异性高
重复性好
多重定量
价格高
只适合特定目标
病原体检测,疾病耐药基因研究,药物疗效考核
遗传疾病的诊断
不同定量方法的比较
横坐标:扩增循环数(Cycle)
纵坐标:荧光强度
每个循环延伸步骤进行一次荧光信号的收集
扩增曲线图
理想的PCR反应:
X=X0*2n
n:扩增反应的循环次数
X:第n次循环后的产物量
X0:初始模板量
在扩增产物达到定值M时:
M= X0 *2 C
log2 M=log2 (X0 *2 C)
log2 M=log2 X0 +log22 C
log2 M=log2 X0 +C
整理得:
log X0 = -C+ log M
C:产物到M值的循环数
log X0 = -C+ log M
M:阈值 C(Cq/Ct):产物到阈值的循环数
Log X0(初始模板量)与 Ct呈反比的线性关系。
公式的成立条件
理想的PCR X=X0*2n 非理想 X=X0*(1+Ex)n
指数增长期(起飞阶段)设定阈值
不同样品间扩增效率的相对差异小
同一样品不同次的扩增效率的相对差异小
相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定,
对数期 Ct值则极具重现性
2种定量目标
检测起始模板数的精确拷贝数
?标准曲线法
病毒感染的定量监测
HIV RNA,HCV RNA
不同处理的样本之间基因的表达差异
2 -△ △ Ct
? 双标准曲线法
药物处理对目的基因表达的影响
病人和正常人目的基因的差异
绝对定量
相对定量
绝对定量——标准曲线
LogX0与Ct呈线性关系,
通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,
根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量
相对定量内参
在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化,以校正因样品初始浓度不同而造成的差异
稳定内参
18S,b-Actin,GAPDH
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定,受环境因素影响小
内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量
双标准曲线法
对目的基因和看家基因做两组标准曲线
待
您可能关注的文档
- 支气管镜在气道管理及气道急症处理中的应用试题.ppt
- 压水堆化学02汇编.ppt
- 压缩语段ket汇编.ppt
- 压缩语段教案汇编.ppt
- 医疗美容行业发展现状---20150601绪论.docx
- 支气管镜在胸部外伤治疗中的试题.ppt
- 支气管扩张的外科治疗进展试题.ppt
- 压缩语段下定义汇编.ppt
- 医疗卫生常识绪论.docx
- 医疗质量评价体系与考核标准(心内、消化、呼吸、肾内、神经内科、肿瘤、儿科、感染科、内分泌)绪论.docx
- 水利水电工程质量检测员继续教育系统基础考试试题及答案(各种收集).pdf
- 毕业论文设计模板.pdf
- 2025年云南省寻甸县第五中学高三下学期教学质量监测(一)数学试题试卷含解析.doc
- 2025年云南省玉溪市师院附中高三数学试题寒假周考试卷含解析.doc
- 2025年云南省玉溪市新平一中高三第一次教学质量监测(4月)数学试题含解析.doc
- 2025年云南省玉溪市新平一中高三下学期考前模拟考试数学试题含解析.doc
- 2025年云南省宣威市第四中学招生全国统一模拟考试数学试题含解析.doc
- 2025年云南省元江民中高三下学期二模(4月)数学试题含解析.doc
- 2025年云南省元江县民族中学高三质量检查数学试题含解析.doc
- 2025年云南省沾益县第四中学下学期期中考高三试卷数学试题含解析.doc
文档评论(0)