荧光实时定量PCR2014绪论.pptx

荧光实时定量PCR 4 基本概念 化学原理 1 2 3 等位基因鉴定原理 数学原理 PCR 典型的PCR四阶段 实时荧光定量PCR PCR扩增反应中 对每一个循环产物荧光信号的实时检测 实现对起始模板定量和定性分析 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质， 随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。 通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线 Real-time PCR VS PCR 1.荧光染料掺入的原理？ ——荧光强度与模板的数量成正比 2.如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？ 荧光实时定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代 EB. 荧光探针杂交技术 两种定量化学 染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 PCR过程中染料的掺入：信号强度与双链DNA分子数正比 扩增曲线 存在的问题 引物扩增的是否是单一的目的基因？ 通过扩增曲线进行目的基因的定量分析 检验方法：熔解曲线 熔解曲线 PCR过程中，可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec) dsDNA解链成为ssDNA SYBR Green I被释放，荧光信号消失 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm Tm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性 熔解曲线 染料的特点 探针标记 Taqman探针 一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。 探针5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。 利用了PCR延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性， 使荧光基团和淬灭基团分离。 热变性，配对 聚合酶，延伸 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 荧光共振能量转移(FRET) Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 10nm 探针的特点 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量 适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 多重定量 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 不同定量方法的比较 横坐标：扩增循环数（Cycle） 纵坐标：荧光强度 每个循环延伸步骤进行一次荧光信号的收集 扩增曲线图 理想的PCR反应： X=X0*2n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 在扩增产物达到定值M时: M= X0 *2 C log2 M=log2 (X0 *2 C) log2 M=log2 X0 +log22 C log2 M=log2 X0 +C 整理得: log X0 = -C+ log M C：产物到M值的循环数 log X0 = -C+ log M M:阈值 C(Cq/Ct)：产物到阈值的循环数 Log X0（初始模板量）与 Ct呈反比的线性关系。 公式的成立条件 理想的PCR X=X0*2n 非理想 X=X0*（1+Ex）n 指数增长期（起飞阶段）设定阈值 不同样品间扩增效率的相对差异小 同一样品不同次的扩增效率的相对差异小 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定， 对数期 Ct值则极具重现性 2种定量目标 检测起始模板数的精确拷贝数 ?标准曲线法 病毒感染的定量监测 HIV RNA，HCV RNA 不同处理的样本之间基因的表达差异 2 -△ △ Ct ? 双标准曲线法 药物处理对目的基因表达的影响 病人和正常人目的基因的差异 绝对定量 相对定量 绝对定量——标准曲线 LogX0与Ct呈线性关系， 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 相对定量内参 在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异 稳定内参 18S，b-Actin，GAPDH 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 双标准曲线法 对目的基因和看家基因做两组标准曲线 待