纸色谱和平板电泳-(第五讲)绪论.pptx

纸层析分离技术 Paper Chromatography  1 目录 一 纸色谱法的基本理论 二 几种特殊类型的纸色谱法 三 应用举例 2 原理：根据溶质A在流动相与固定相（纸纤维中吸着的水分）中的分配系数不同，流动相因毛细现象沿纸上升，KD大的前进慢，KD小的上升快，因而溶质得到分离。 3 固定相——滤纸上的吸附水 (或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇处理) 流动相——溶剂 （乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶的溶剂） （但也有人认为属离子交换色谱和吸附色谱或三者皆有） 一 . 基本原理 4 纸色谱示意图 Δ Rf 0.02，A、B可分离. 与标样比较可定性鉴定 氨基酸的Rf值 展开剂 正丁醇+吡啶+水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24 1 : 1 : 1 正丁醇+醋酸+水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11 12 : 3 : 5 5 1. 展开剂种类 二. 影响Rf的因素 3. 温度的影响 6 2. 滤纸的性质 粘稠展开剂(正丁醇等) 快速滤纸 黏度小的展开剂(石油醚等) 慢速滤纸 4 . 展开方式 上行 慢(常用) 下行 快( 适用于比移值小的溶质) 影响分配系数的变化，而且展开剂组成也受温度影响而有一定程度改变，但影响较小。一般不需要特别的恒温装置 三. 纸色谱法的基本操作 3.1 纸的准备 3.2 点样 3.3 展开 3.4 显色及定位 3.5 定量 7 3.1 纸的准备 一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件： （1） 滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质。 （2） 滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕和损伤。即应具有一定的强度。 （3）?滤纸对溶剂的渗透速度应适当，渗透速度太快时易引起斑点拖尾，影响分离效果，速度太慢时，耗费时间太长。 （4）?纸质应均一，否则会影响实验结果的重复性，特别是定量实验中这点更是重要。 8 层析纸按需要剪裁成长条形（或筒型） 9 3.2 点样 用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。 3.3 展开 10 展开时必须在密闭的容器中进行。 展开剂不得浸泡到点样线 一元展开 二元展开（双向展开） 多段展开 将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降），实现试样的分离 11 例：氨基酸混合液点在15×15cm滤纸边2cm处，风干，展开剂用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），当溶剂移动至14cm处，取出风干。（第一次展开） 将滤纸折成筒状，使斑点处于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺(10:10:5:1) 展开至14cm，取出风干。(第二次展开) 显色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-冰HAc 第二次展开 双向纸色谱法 第一次展开 3.4 显色及定位 经上述展开至溶剂前沿到达纸的另一端时，即可将纸取出，待溶剂挥干后用适宜方法确定组分斑点的位置 12 有色物质，展开后即可直接观察到各个色斑 紫外光照射下产生荧光，观察荧光（例如生物碱） 喷以试剂使斑点显色（显色剂，碘蒸气熏或氨水熏等） 13 显色举例 1．磺胺类药物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶混合物的分离和检出，可用 1% 的氨水作展开剂，用对二甲胺基苯甲醛（即 Ehrlich试剂）乙醇溶液作显色剂。[5] 2．氨基酸的分离和检出，一般需用双向层析。先用酚：水（7：3）作展开剂进行第一次展开；再用丁醇：醋酸：水（4：1：2）作展开剂进行第二次展开，可分离出近 20 种氨基酸。展开后喷以茚三酮的丁醇溶液，使之显色。[1] 3．纸上层析法不但可用于分离各种常见无机离子，由于它需用试样量很少，因此在各种贵金属和稀有元素的分离方面也已得到了很好的应用。例如金、铂、钯、铑离子的分离，可用乙醚：丁醇：浓盐酸（1：2：2.5）混合溶液作展开剂，展开后喷以 SnCl2溶液、金、铂、钯立即出现色斑，铑则在稍温热后显色。铑、钌、钯、铂、铱、金离子的分离则可用 N-N二仲辛基乙酰胺为固定相，5M HCl 溶液为展开剂进行纸上反相层析等。 3.5 定量 1.洗脱测定法 操作步骤多，测定时间长，但洗脱法不需要贵重仪器设备、测定结果有较好的准确度。 14 紫外分光光度法、比色法及其它方法如极谱、库仑滴定、荧光测定等。 2 直接测定法 a 目测法 样品经分离后，直接观察所