植物源农药的提取分离及结构鉴定修改版试题.ppt

原理是利用被分离的各个组分在互不相容的固定相和流动相中溶解度不同，在试样组分随流动相移动通过色谱柱的过程中，组分在两相中不断建立、打破和重新建立分配平衡。平衡时组分在固定相（s）和流动相（m）中的浓度之比成为分配系数。因为不同组分的分配系数不相同，他们在柱中经过多次的分配平衡后，产生了差速迁移，从何彼此分离。组分间分配系数K相差越大，越易分离。 * 4、凝胶层析 （Gel Penetration Chromatography, GPC） ① 葡聚糖凝胶 交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂（一般为环氧氯丙烷）以醚桥的形式互相交联形成的三维空间网状结构高分子材料，是水不溶性的白色球状颗粒，酸性环境能水解，碱中稳定。 在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经路径的不同，使不同相对分子量的组分得以分离的方法。 表面有孔隙，其大小决定于聚糖与交联剂的配比及反应条件。 商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示，英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的数字表示每克凝胶吸水量，再乘以10的值，G-25的吸水量为每克2.5ml。 交联度大→网状结构越紧密→孔隙越小→吸水膨胀越少。 型号 吸水量 （ml/g） 床体积 （ml/g） 分离范围 最小溶胀时间 肽与蛋白质 多糖 室温 沸水 G-10 1.0 2~3 小于700 小于700 3 1 G-15 1.5 2.5~3.5 小于1500 小于1500 3 1 G-25 2.5 4~6 1000~5000 100~5000 6 2 G-50 5.0 9~11 1500~3万 500~1万 6 2 G-75 7.5 12~15 3000~7万 1000~5万 24 3 G-100 10 15~20 400015万 1000`10万 48 5 G-150 15 20~30 5000~40万 1000~15万 72 5 G-200 20 30~40 5000~80万 1000~20万 72 5 凝胶的型号与使用范围 ②层析原理 绝大部分在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当溶剂中浸泡，待充分膨胀后装入层析柱，加样后用同一溶液洗脱。在洗脱过程中，较小的分子渗入凝胶，较大的分子随溶液流动，分子量小的物质（阻滞作用大）可通过凝胶网孔进入粒子内部，然后扩散出来，故流程长，移动速度慢，后流出色谱柱，分子量大的物质沉凝胶粒子间孔隙，随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先流出色谱柱。 不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰相反，保留时间较长）而得以分离 。 常用术语 Vt—— 床体积，凝胶装柱以后，柱床所占的体积。 Vo——外水体积，柱床内存在于凝胶外面的水相体积。 Vi——内水体积，凝胶颗粒内部所含的水相体积。 Vg——凝胶本身体积。 相互关系：Vt= Vo+ Vi+ Vg Ve——洗脱体积，自样品加入时算起，至流出组分最大浓度出现时，所流出的体积 。 同一类型化合物，洗脱特征与组分分子量有关。 Ve=K1-K2logM 说明不同组分流经凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的，洗脱体积小，最先流出，当条件固定时，Ve重现性很好。 按此特性可测大分子物质的分子量。 用已知分子量的物质分别相继上柱（5mg），流出液按每管2~4ml收集，通过硫酸蒽酮显色，再经紫外检测，分别求得洗脱体积Ve。再用蓝色葡聚糖测出柱床的外水体积Vo，按Ve /Vo与分子量对数关系作图，得标准曲线，最后将待测物质分子量用少水溶解上柱，在同样条件下测定Ve，根据Ve/Vo，查标准曲线，测得物质分子量。 局限性： 1、要有标准样。 2、不同的待测物质要有不同的标准样。 操作技术： 溶胀：不同凝胶溶胀时间不一样，G-100室温下最小水化时间72h，除微颗粒。目的：充分吸水，各孔隙舒张，以利于物质分子通过。 装柱：柱内加少量洗脱液，排除底部气泡，然后将凝胶浆倒入，让其自然沉降，打开出口，柱床表面不再下沉即紧密。装好的柱应不含气泡，柱床表面平坦。 平衡：用3倍床体积洗脱液让柱平衡流动2-3天，至流速恒定。 加样：平衡后，床表面应有1~2cm的洗脱液，用吸管沿柱壁加入，打开出口，当上面液体刚好全部渗入柱内时，滴加洗脱液，注意不能振动床表面。