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第4章 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 4-1 概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。 基本理论 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器 1．HPLC法与经典液相色谱法区别 高压：供液和进样压力大，150-350×105Pa 高速：在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1. 高效：一次分析同时分析多达几十甚至上百个组分 例: 分离苯的羟基化合物，7个组分1min就可完成。 氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分。 2．HPLC法与气相色谱法区别 区别一 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％(分子量＜200)。 高效液相色谱法主要用于进行分离、分析对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质(200＜分子量＜2000)。 续前 区别二 气相色谱法流动相采用惰性气体，对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用 高效液相色谱法流动相选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 续前 区别三 气相色谱法一般都在较高温度下进行 高效液相色谱法则经常在室温条件下工作 4-2 高效液相色谱法固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。 按孔隙深度分类，可分为： 表面多孔型和全多孔型固定相。 1 表面多孔型固定相 基体是实心玻璃珠，外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、聚酸胺等。 表面活性材料为硅胶的固定相如国外的Zpax，Corasil I和II，Vydac，Pellosil以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如Pellumina；为聚酰胺的，如Pellion。 2 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。 如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。 4-3 高效液相色谱流动相 在气相色谱中可供选择的载气只有3-4种，性质差异不大，流动相不参与组分分离选择。 高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争，流动相的种类、配比能显著影响分离结果，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。 流动相溶剂的要求（不同的色谱分离类型流动相组成不同） （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。 对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 对于示差折光检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。 4-4 高效液相色谱法的主要类型 液-液分配色谱（化学键合相色谱法） 液-固色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱法 离子色谱法 空间排阻色谱法 亲和色谱法 （一）液-液分配色谱法（LLPC） 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,能适用于各种样品类型的分离和分析：极性的和非极性的、水溶性和脂溶性、离子型的和非离子型的化合物。 1．液液分配基本理论 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，