转基因植物的鉴定.pptVIP

转基因植物的鉴定 进行基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上的外源基因是否表达，这一系列的问题仍需回答，只有获得充分的证据后才可认定被检测的材料是转基因的。 目前认为转基因植物的证据应有以下几点： ①要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）； ②转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生物学证据、物理数据（southern杂交，northern杂交，western杂交）与表型数据（酶活性分析或其它）； ③提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫、抗病等）； ④根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无性繁殖）提供遗传证据。有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。 外源基因整合的鉴定 　　证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是DNA Southern分子杂交，只有经过分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。 若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。 探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。 这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段。 它具有灵敏性高（可检出10-12g，即1pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点，是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法。 根据杂交时所用的方法，核酸分子杂交又可分为印迹杂交、斑点（dot）杂交、狭槽（slot）杂交和细胞原位（in situ）杂交等。 鉴定转基因植株所涉及到的核酸分子杂交有Southern杂交及Northern杂交。 Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，不仅可鉴定外源基因的整合，还可初步鉴定插入的拷贝数。 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称。 它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，根据检测的目的片段及一定的原则设计引物，与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤的数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可以在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA片段扩增数百万倍。 PCR检测所需的模板量仅为10ng以内，而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增效果，因而这一技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。 外源基因转录水平的鉴定 基因表达分为转录及翻译两阶段，转录是以DNA（基因）为模板生成mRNA的过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白质的过程，检测外源基因的表达就是检测特异mRNA及特异蛋白质的生成。 所以基因表达检测分为两个水平：即转录水平上对特异mRNA的检测和翻译水平上对特异蛋白质的检测。 转录水平上的检测主要方法是Northern杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测RNA链。 和Southern杂交相同，Northern杂交包括斑点杂交和印迹杂交。 也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方法检测外源DNA在植物体内的转录表达。 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增。 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。 外源基因表达蛋白的检测 表达蛋白的检测方法有三种：①生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；②免疫学检测法：通过目的蛋白（抗原）与其抗体的特异性结合进行检测，具体方法有Western杂交、酶联免疫吸附法（ELISA）及免疫沉淀法；③生物学活性的检测。 Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS）电泳分离抗原（Antigen）固定在固体支持物上（如硝酸纤维素膜，NC膜）。 不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同，据此可确定特定的抗原存在与否以及相对丰度，或者蛋白质是否遭到降解等。 蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭非特异性位点，然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交，抗原-抗体结合，再通过放射性自显影或显色观察。 ELISA与经典的同位素标记为基础的液－液抗原－抗体反应体系不同之处在于建立了固－液抗原抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。 由于酶的放大作用，使测