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基因工程 第一章 绪论 1、基因工程的含义： 按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。 2、基因工程的优点： ①打破物种间基因交流的隔离界限；②克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；③可按照人的意愿去改造物种。 3、基因工程理论依据： ①不同基因具有相同的物质基础；②基因是可分割的；③基因是可以转移的；④多肽与基因之间存在对应关系；⑤遗传密码是通用的；⑥基因可以通过复制传递给下一代。 注：基因工程及其应用的图解看看 第二章 DNA重组的相关技术及原理 1、重组DNA技术的原理 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 2、碱性SDS法提取质粒DNA 原理 ：强碱使所有DNA变性沉淀，而pH为中性时，质粒DNA复性快，形成闭合环状从沉淀物中分离。 3、提取DNA总的原则 ① 保证核酸一级结构的完整性； ②其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； ③ 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ④其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 4、核酸鉴定 ①浓度鉴定 ②纯度鉴定 ③完整性鉴定 5、限制性核酸内切酶 ：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 6、限制性内切酶的命名 ①用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌 （Escherichia coli）Eco 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）Hin 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoR）。 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae D 嗜血流感杆菌D株 Hind III EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 7、限制性核酸内切酶的作用机制 以环状和线形的双链DNA为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH基团和5’－P基团的片段。 8、同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。 如XmaI 和 SmaI。 9、同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等 10、酶活性单位（U)：在最适反应条件下，一个DNA分子上含有一个酶切位点，60 min内切割1 (g λDNA所需的酶量称为一个单位。 11、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 12、基因工程的其他酶 （1）DNA连接酶 :DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。; （2）DNA聚合酶 （ Klenow fragment） 性质 ①5’(3’聚合酶活性。②3’(5’外切酶活性。（失去了5’(3’外切酶活性） 用途 ① 3’端补平 ② DNA 的3’3’隐蔽端加上标记的dNTP。 ③ cDNA第二链的合成 ④ 双脱氧末端终止法测定DNA序列 S1 催化反应类型: ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 13、聚合酶链式反应PCR : PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 加入4种物质： （1） 作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 14、PCR技术的原理 （1）DNA模板变性（2）DNA模板与引物复性（3）DNA链的延伸 15、PCR的过程 第一步 预pre-denature） 90-95 oC下5分钟，模板DNA双链完