基因突变与蛋白质工程介绍.pptVIP

四、基因突变与蛋白质工程 基因突变 基因组DNA分子在结构上发生碱基对中组成或顺序的改变，并引起个体表型的改变，而使生物体发生遗传性变异。 蛋白质工程 蛋白质设计或蛋白质工程是指用遗传方法修饰蛋白质序列。 基因突变 引起基因突变的原因 物理因素 化学因素 生物因素 突变剂、自发突变与诱发突变 基因突变的分类 按照突变过程 自发突变 诱发突变 按发生的细胞种类 生殖细胞突变 体细胞突变 基因突变的分类 从对三联体密码基对遗传信息的改变来分 同义突变 错义突变 无义突变 按照DNA序列的改变情况 点突变 碱基插入突变 碱基缺失突变 移码突变 突变技术 随机突变 区域随机诱变 点突变 寡核苷酸介导的点突变 PCR定点突变 随机突变 寡核苷酸介导的点突变-寡核苷酸引物诱变 诱变技术的原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸段片段作引物，启动单链噬菌体M13进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，新合成的子链便具有发生突变的碱基序列。 诱变程序 退火 合成全长互补链 封闭缺口 转染 突变体筛选、鉴定和回收 用核素标记的诱变剂寡核苷酸作为探针进行杂交筛选 该探针同野生型DNA之间存在错配碱基，在漂洗时易解离，而与突变DNA之间形成的杂交体不发生解离 先测序无误后，从噬菌体基因组双链复制型中回收外源DNA，然后将突变的片断取代野生型DNA同源片断，并通过适当的方法测定突变的表型效应 同源重组机制 寡核苷酸介导的点突变-盒式诱变 以各种双链质粒DNA为载体，利用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段置换待改造基因中两个限制酶切位点之间的序列，在转化的大肠杆菌中形成数量众多的的突变体。 PCR点突变 引物PCR定点突变法 重组PCR定点突变法 引物PCR定点突变法 原理 以第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的大引物，故又称大引物PCR诱变法。 优点 简便、产生错配的机会很小 重组PCR定点突变法 原理 采用目的突变的寡核苷酸引物，以靶基因的质粒为模板，由PCR产生的同源DNA末端在E. coli通过体内重组，产生具有目的突变的同源DNA末端的DNA片段，转化后在菌体内重组成环状并携有点突变序列的质粒。 点突变技术的应用 在分子生物学和基因工程中的应用 在蛋白质工程上的应用 （1）提高蛋白质的生物活性和稳定性 （2）减低多肽产品的毒性作用 （3）改变亚型和种属特异性 （4）增高蛋白质作用的专一性 已知编码基因 结构或结构模型已知 随机诱变（易错 PCR，基因改组） 改良的突变体 的计算机模型 位点特 异性突变 通过分析进行实验验证 重复循环几次 重复循环几次 蛋白质工程 蛋白质工程举例 酶 方法 突变 影响 洗涤剂蛋白酶 理性设计 222met→ala 对氧化作用稳定 人胰岛素 理性设计 22lys →pro 降解变慢 组织纤溶酶原激活剂 理性设计 缺失kringle2 降解变慢 青霉素酰化酶 定向进化 5位 更好的溶剂稳定性 P450脂肪酸水解酶 定向进化 4位 显著改良了底物特意向 * *