双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量.docVIP

实验 双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量 一、目的要求 1．学习双缩脲法的基本原理及操作。 2．通过实验学会制作标准曲线。 二、实验原理： 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、操作方法： 1．标准曲线的制作。酪蛋白：mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。） 管号 1 2 3 4 5 6 酪蛋白 ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水 ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 双缩脲试剂 ml 混匀，放置30分钟 A540 0 ，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。） 混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。 四、样品处理 1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）； 2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟； 3．离心，4000rPm，离心15分钟； 4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。） 五、计算 OD值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％ 即面粉中酪蛋白的百分含量。 ： 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O 6.0g 酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）500ml蒸馏水中,搅拌加入300ml的10％NaOH（KOH）（ lg KI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），l000ml。此试剂存于棕色瓶中避光可长期保，若有黑色沉淀产生需重配。 【注意事项】 标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计。注意事项 （1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg蛋白质。 （2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 （3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。