Exp01E.coli染色体DNA提取2012课件.ppt

基因工程实验 Gene Engineering 30学时 实验课设计的思路 蛋白质核心 超螺旋DNA环 实验一、E.coli染色体DNA提取 一、实验目的 掌握E.coli基因组DNA的提取方法, 制备高质量的gDNA,用作PCR模版 通过冻融、溶菌酶或EDTA处理，并用去垢剂使细胞裂解，释放出DNA，然后用RNA酶和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解，再用苯酚/氯仿抽提，离心，去除蛋白质，用乙醇沉淀DNA。 二、实验原理 裂解液/Pro K 灭活胞内核酸酶 吸附于硅基质膜 漂洗-离心-洗脱 试剂盒提取原理 （一）材料 大肠杆菌培养物 （二）试剂 常规方法所需试剂 LB培养基 GTE: 50 mmol/L葡萄糖, 25 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 100 mg/ml溶菌酶 20 mg/ml 蛋白酶K(Pro K) 三、实验材料、试剂及用具 酚/氯仿/异戊醇(PCI)，体积比为25:24:1，采用Tris-HCl(pH8.0)饱和酚。 3mol/LNaAc (pH5.2) 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 1mmol/L EDTA (pH8.0) 20 mg/ml RNaseA酶 裂解液LB2 结合液BB2 清除液CB2 漂洗液WB2 试剂盒的组成 洗脱液EB RNase A(20mg/ml) Pro K (20mg/ml) 离心柱,收集管 （三）用具 恒温摇床,培养箱, 灭菌锅,超净台,微量移液器,枪头,EP管,恒温水浴锅,台式离心机,漩涡混合器,冰箱等 常规方法 1. 收集菌体: 1ml菌液/1EP管, 12000rpm, 1?,弃上清 2. 加600?l GTE,振荡混匀 3. 加6?l溶菌酶,混匀,37℃,30? 4. 加6?l Pro K,混匀,55℃,1h 5. 加等体积PCI,混匀, 12000rpm, 5? 6. 转移上清至新管,加等体积氯仿/异戊醇, 12000rpm, 5? 7. 取上清至新管,加?V 3mol/L NaAc (pH5.2),混匀,加2倍体积的无水乙醇,上下颠倒混匀,?20℃,30?, 12000rpm, 10? 8. 弃上清，取1mL70%乙醇洗涤沉淀, 12000rpm, 5? 9. 干燥后用20?l TE(含RNaseA酶)溶解,37℃,30? 10.检测DNA质量，?20℃保存 四、实验方法 试剂盒方法 1. 收集菌体: 2ml菌液/2人, 12000rpm, 1?,尽量吸净上清 2. 加100?l LB2和20?l ProK, 振荡至菌体彻底悬浮 3. 55℃孵育,15? 4. 加20?l RNase A,室温孵育2? 5. 加500?l BB2,立即涡旋5s,室温10? 6. 全部溶液加入离心柱, 12000rpm,30s,弃流出液 7. 加500?l CB2, 12000rpm,离心30s,弃流出液 8. 重复步骤7一次 9. 加500?l WB2, 12000rpm,离心30s,弃流出液 10. 重复步骤9一次 11. 12000rpm离心2?,彻底去除残留的WB2 12. 离心柱置于新EP管,柱中央加200?l预热EB,放 置2?, 12000rpm, 离心1? 13. 洗脱的DNA于?20℃保存 P33思考题 3. 提取染色体DNA的基本原理是什么? 在操作中应注意什么? 4. 在使用苯酚抽提DNA时应注意什么? 五、作业 * 本实验课程以一个基因片段的获得,表达和纯化和活性分析为主线,抓住蛋白和核酸两大主题,建立一个综合型和研究性的大实验教学体系,重视各项技术的衔接,启迪学生的科学思维和创新意识,提高学生对实验方法和实验技术的综合运用能力 * 大肠杆菌染色体DNA结构 * 氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分离 * 独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱 * 先配制100 mM 的Tris-HCl (pH8.0)和200 mM 的EDTA (pH8.0),混合而成Buffer A; ethanol, alcohol * 注意事项: ?Tris-饱和酚的使用; ?避免剧烈振荡; ?EP管的使用; 酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时,蛋白分子之间的水分子就被酚-氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白的密度比水的密度大,因而与水相分离,