生物化学实验指导自编.doc

生物化学实验指导 生物机电实验中心自编讲义 实验一 生化实验基本操作 4 实验二 缓冲溶液 9 实验三 功能基实验 11 实验四 糖的性质实验 14 实验五 蛋白质的性质实验 16 实验六 蛋白质含量的测定（凯氏定氮法） 18 实验七 氨基酸的纸层析 20 实验八 凝胶层析法分离血红蛋白与糜蛋白酶 23 实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 26 实验十 肝组织核酸的分离与鉴定 28 实验十一 核酸的定量分析 30 实验十二 温度、pH等对酶促反应速度的影响 32 实验十三 碱性砱酸酶Km数值的测定 34 实验十四 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 36 实验十五 胡萝卜素的柱层析分离法 37 实验十六 比色分析法及7220型分光光度计的原理和使用 39 实验十七 维生素C的提取与定量 45 实验十八 血中葡萄糖含量的测定 46 实验十九 糖酵解 48 实验二十 肝糖原的提取与鉴定 50 实验二十一 血清总胆固醇的测定 51 实验二十二 肝的生酮作用 53 实验二十三 薄膜层析法分离血清脂类 54 实验二十四 血清甘油三酯的测定 55 实验二十五 氨基移换作用 57 实验二十六 血清谷丙转氨酶的测定 58 实验二十七 血浆二氧化碳结合力的测定 61 实验二十八 维生素C的定量测定 62 实验二十九 脂类组成对脂类单分子层通透性的影响 65 实验三十 粘多糖—肝素钠效价的测定 67 实验三十一 细胞色素C的制备和测定 69 实验三十二 枯草杆菌碱性磷酸酶的制备及酶活力的测定 73 实验三十三 酯酶的分离、纯化与活性测定 77 实验三十四 蛋白质浓度测定――紫外线(UV)吸收法 81 实验三十五 核酸浓度测定――紫外线(UV)吸收法 84 实验三十六 酵母RNA提取与地衣酚显色测定法 87 实验三十七 猪脾脏DNA提取与二苯胺测定法 90 实验三十八 植物DNA的提取 94 实验三十九 鼠肝DNA的制备 95 实验四十 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳 100 实验四十一 SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量 106 实验四十二 蛋白质印迹免疫分析 110 实验四十三 大鼠肝总磷脂的提取及薄层色谱分析 112 实验四十四 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 115 实验四十五 大蒜细胞SOD的提取与分离 119 实验四十六 离子交换柱层析分离核苷酸 120 实验四十七 离子交换柱层析法分离氨基酸 127 实验一 生化实验基本操作 一. 玻璃仪器的洗涤 在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。 ㈠ 常用的洗涤方法： 1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。 2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。 3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。 4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。 5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。 ㈡ 使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点： 1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。 2.Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。 3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。 4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。 5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。 注：重铬酸钾洗液的配制 取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后