醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白.docVIP

本次实验项目： 实验二　醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白 本次实验课时：5学时 教学要求： 1．掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 2．学会使用38B型电泳槽及点样技术。 重 点：滤纸桥的制做、薄膜的处理、点样 难　　点：点样 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．相关知识……………………………………………………………　　……　 0.1 学时 2．实验目的…………………………………………………………………　　… 0.1 学时 3．实验原理……………………………………………………………………　　 0.3 学时 4．实验操作 ……………………………………………………　　… 0.2 学时 实验教学 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白…………………………………… 4 学时 参考资料 《生物化学实验》 实验教学教案首页 醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白（验证性） 相关知识 １．血清蛋白：血清中含有多种蛋白质，它们之中有的和某些糖类结合，形成糖蛋白。 人血清中蛋白质的等电点及相对分子质量 蛋白质名称 等电点（pI）消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 ３．氨基黑： 是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区有很大的亲和力。因此，以凝胶基质作为电泳支持物时由于亲水的凝胶基质与氨基黑有很大的亲和力，不容易漂洗，一般不使用它进行染色。 ４．根据电荷不同的纯化方法之一――― 电泳 ５．血液：分为血细胞和血浆 ①血细胞：包括 红细胞 白细胞 血小板（凝血） ②血浆：是不含血细胞的。血浆中溶解着蛋白原，它可转变成不溶性的蛋白。α1、α2和β-球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，β、γ-球蛋白升高；急性炎症时，α1、α2-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，α2、γ-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ-球蛋白区带之间出现“M”带。 一、实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基不同，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷也不同，因此，在电场中迁移速度不同。在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示五条区带。该方法目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、同工酶、多肽、核酸及其它生物大分子。具有操作简单、快速、廉价的特点。 三、实验仪器、材料与试剂 　（一）实验仪器 DYY-Ⅲ型电泳仪、38B型电泳槽、染色和脱色装置（自制）、血色素点样器（自制）、单面刀片、镊子、吹风机、普通滤纸、醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）。 （二）材料　新鲜人血清 （三）试剂 巴比妥—巴比妥钠缓冲液：（pH8.6,0.07mol/L，离子强度0.06）；称取1.66g巴比妥（A.R）和12.76g巴比妥钠 A.R ，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000 ml，置4℃保存备用. 血清蛋白染色液: 称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇 A.R 50 ml，冰乙酸 A.R 10 ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。 漂洗液：取95%乙醇 A.R 45 ml，冰乙酸 A.R 5 ml，和蒸馏水50 ml，混匀置具塞试剂瓶贮存。 透明液：透明液甲：取冰醋酸 A.R 15 ml，无水乙醇 A.R 85 ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用； 透明液乙： 取冰醋酸 A.R 25 ml， 无水乙醇 A.R 75 ml， 混匀置试剂瓶内,塞紧瓶塞，备用。 四、实验操作步骤 1．薄膜的准备 置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30分钟方可用于点样。取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干。 cm处），使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。 4．电泳 用镊子将薄膜加样端平贴在电泳槽阴极端滤纸桥上且薄膜点样面朝下（光滑面朝上），中间不能下垂，盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。点样端接负极，打开电源开关，调节到每厘米膜宽度电流0.5 m