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实验九 从土壤中分离纯化微生物 一、实验目的1.学习从混杂的微生物群体中分离纯化微生物的方法，掌握分离纯化的基本操作技术。2.学会从菌落及培养特征辨别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物 二、实验原理 在自然界里，微生物的种类繁多，数量很大，几乎都是杂居在一起的，为了适应工、农、医发展的需要，常常从自然界中分离，以获得新的种。土壤是微生物的大本营，在土壤物质转化中具有多种重要作用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又是工业和医药用菌的资源。纯种分离是从含有很多种微生物的自然材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由一个个体繁殖而来的，故可获得了纯种。这种获得单个菌株纯培养的方法称为微生物的分离和纯化 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有1.简易单细胞挑取法它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。  2.平板分离法该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。 三、实验材料(一)材料 土壤样品、马丁氏培养基、高氏一号培养基、查氏培养基、豆芽汁培养基。(二)器材 无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。  四、实验操作1.稀释分离法（1）稀释土样 称1g土样，在火焰旁加到有99mL无菌水和少许玻璃珠的三角烧瓶内，将瓶子依左右方向振荡数十次，使土样与水充分混合，将菌分散，土样中的菌被稀释了100倍，土壤悬液的稀释度为10-2。用无菌吸管吸取土壤悬液lmL，加到一个盛有9mL无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3。的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出lmL菌液，加到另一支9mL无菌水中，制成稀释度为10-4的土壤悬液（图2-1）。用微量加样器亦需反复吸吹3次，用毕弃去塑料吸嘴。 同法按每级稀释10倍的次序得到lO-5、10-6的土壤稀释液，稀释完后，用最后一支吸管（或塑料吸嘴），由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2mL加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-5、10-4试管中各吸取0.2mL稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。  五、实验结果 分别记录并描绘四大类微生物生长情况和培养特征。 六、思考题 为什么要将培养皿倒置培养？ * * 图2-1 从土壤分离微生物操作过程 （2）倒平板：将培养基加热融化，待冷至55～60℃时，倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手撑边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml(图2-3)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 图2-3 倒平板 2.平板划线分离法 将融化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，待冷凝后，左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接种环取稀释样品一环在平板上划线，划线分离后，置于37℃温箱中，培养1～2d，即出现单个菌落。划线分离方法见图2-4，图中1、2、3表示划线次序。 图2-4 划线分离方式 将分离固氮菌的培养皿（无氮培养基）置于（倒置）300C恒温箱中，培养24小时；分离的放线菌（高氏一号培养基）培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养7天；分离的霉菌（查氏培养基）培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养4天；分离的酵母菌（豆芽汁培养基）的培养皿置于（倒置）280C恒温箱中培养48小时。 从不同平板上选择不同类型的菌落进行肉眼观察，区分细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的菌落形态特征。用接