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第七章 免疫电镜 一 电镜免疫组织化学技术概述 特异性抗体用电子致密物质,如铁蛋白、胶体金等标记后,使之与组织超薄切片中的抗原结合,在电镜下观察到标记物所在位置,即为抗原抗体反应的部位。 (一)组织固定与取材 原则: 既要保存良好的细胞超微结构,又要注意保持组织的抗原性。 固定: 固定剂的要求: ①不损害细胞内抗原的活性; ②固定速度快、效果好; ③分子量小,易于渗透; ④固定后,不引起交联,造成空间的阻碍,影响标记抗体进入抗原位。 影响固定的因素有: ① 固定剂的种类; ② 固定剂的浓度,浓度过大,对抗原的活性有影响,浓度过小,固定效果差; ③ 固定剂的pH; ④ 固定剂的温度,一般采用2℃~4℃冷固定;这样能降低细胞自溶作用和水分抽提; ⑤ 固定时间与温度有关,温度高,固定快,也与缓冲系的离子强度有关,离子强度大,渗透压大,穿透力强,固定要快。不同的固定剂,或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致; ⑥ 与被固定的细胞类型有关。 选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛—戊二醛混合液 过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液): 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。 (使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价,作为失活参考以再选择最适条件。) (二)免疫染色 包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色 1 包埋前染色 即先行免疫染色,在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出,修块;常规电镜方法处理,经锇酸固定、脱水、树脂包埋。 特异性免疫反应的范围太小,可作二次包埋: 即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间,中夹环氧树脂如夹心面包式,进行高温聚合,然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。 包埋前染色的组织,以中层较为理想。 表层因受机械修整,结构保存不好,深层因抗体不能透入,免疫反应弱或无。 半薄切片可在相差显微镜下不染色观察(PAP),免疫反应部位呈黑点状; HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上,免疫反应部位呈棕黄色。 取相连续的超薄切片 为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆,分别以两个铜网捞取,其中之一进行染色观察,另一以铀单染色或不染色进行对照观察。 2 包埋后染色(载网染色) 组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片; 免疫组化染色(载网染色) 注意事项: ① 四氧化锇具有保存抗原的作用,但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳,或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。 优点: 超微结构保存较好,方法简便,阳性结果有高度的可重复性, 还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。 缺点: 抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失; 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质; 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。 3 超薄冰冻切片 将组织置于蔗糖保护液中,以液氮速冻; 在冰冻超薄切片机上切片; 免疫染色。 不需经固定、脱水、包埋等步骤,所以抗原性保存 较好,兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。 (三)包埋 树脂包埋、低温包埋 2 低温包埋 1)包埋剂的配制: 由三个部分组成:单体,交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例,增加交联剂,可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块,其配制比例如下: K4M:单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色玻璃容器避光,用 玻棒轻搅3—5 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌, 以防氧的气泡进入包埋剂中。 2) 生物样品处理程序 ① 取材,以多聚甲醛一赖氨酸—过碘酸钠固定; ② 含7%蔗糖PBS,冲洗过夜; ③ 0.1 mol/LPBS, pH 7.2冲洗; ④ 系列脱水; 3) 免疫染色 ① 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上; ② 正常羊血清30 min; ③ 稀释一抗,37℃2h; ④ 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法),以镊夹镍网在烧杯中洗荡; ⑤ 正常羊血清30min。 (2)LR white和LR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂; 具有极低粘度和较强嗜水性,穿透性强,有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂,达到组织结合部位; 在免疫细胞化学的光镜(半薄切
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