基因的克隆与转化课件.ppt

实验四 基因的克隆与重组质粒的转化 实验目的 掌握外源基因与载体连接的原理及方式 理解重组体转化大肠杆菌的条件 了解转化的过程 实验步骤及原理 纯化载体 特定基因与载体连接 重组载体转化大肠杆菌 筛选含重组子的大肠杆菌 载体 外源DAN片段不能在细菌中稳定遗传，随细菌的繁殖而扩增。须有载体携带进入宿主细胞 专为分子克隆提供的载体特点： 多为环形 含多克隆位点，可选择适当内切酶切开 含抗药基因，可使宿主在含某种抗菌素的培养基上存活 可在宿主细胞中自我复制，也可随宿主细胞的繁殖而扩增 外源基因与载体连接 外源DNA片段与载体的连接有多种方式，选择不同酶切，连接方式也不同。 单酶切产生平端切口，与外源DNA片段连接，效率很低。因Taq酶的特殊活性，PCR产物3‘-末端常有突出的A。针对此特点，有3‘-末端突出的T载体。 单酶切产生粘末端，连接效率较高，但因载体两端的粘末端相同，故外源DNA片段的连接没有方向性，载体本身也容易回连。 双酶切产生粘性末端，连接效率高，且可确定插入片段的方向。 单酶切产生平端切口 单酶切产生粘末端 双酶切产生粘性末端 重组载体转化大肠杆菌 转化的关键是制备感受态细菌，使受体菌处于易于吸收和容纳外源DNA的易感状态。常用方法是氯化钙冰浴法。 0oC条件下用低渗CaCl2 溶液处理快速生长的细菌，使细胞壁疏松，细菌膨胀成球形。 重组DNA分子易吸附于感受态细胞表面