北京大学医学部-实验动物学-基因打靶2012课件.ppt

基因打靶 （Gene targeting） 郭长占 北京大学医学部 E-mail: guo4626@. 技术先进性 实现转基因定点整合 (一)基因打靶的原理 基因打靶(gene targeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。 打靶载体(targeting vector)。 如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。 基因打靶的结局有如下可能： (1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。 (2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。 (3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。 (二)基因打靶的方法： 进行基因打靶要经历以下步骤： （1）构建打靶载体。 （2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonic stem cell，即ES细胞)。 （3）打靶ES细胞导入囊胚。 （4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。 1. 打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。 通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子，框图表示外显子 2. 外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3 － 5天)内细胞群分离的细胞。 1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。 英国卡迪夫大学(Cardiff University)卡迪夫生命科学学院Martin J. Evans 外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法 外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵抗G418 而不能利用GANC。 G418 GANC 正负选择法的原理 在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neor)插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标（或者是靶基因最关键的外显子中）； neor可以抵抗G418.在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV－tk)基因序列作为负选择标志。HSV-tK可以利用GANC而导致细胞死亡。 同源重组（基因打靶 Gene Targeting） 如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组，外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV - tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neor基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来。 随机整合(Random Integration） 如果导入的外游基因与细胞基因组随机整合，打靶载体将从头至尾全部整合入靶细胞基因组中，这种情况下，标志基因neor、HSV – tk同时整合与表达。neor基因的产物使细胞具有G418抗性，而HSV－