08-3h-定点突变与基因打靶技术(李冬民).pptVIP

由于在真核细胞内发生同源重组的机率非常低，因此要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就成了基因打靶要解决的关键技术问题。 基因打靶筛选系统 1. 正向选择法： 正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。其原理是：构建一个特殊的载体，此载体所携带的正向选择标记基因本身没有自己的表达调控因子，而只能利用靶位点上相应的表达调控元件来启动表达，从而发挥选择标记的作用。根据所用的表达调控元件的不同，此法又可分为无启动子筛选法和无Poly(A)筛选法。 2. 正负筛选法（positive and negative selection, PNS） 这是目前最为常用的方法。正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Neo基因作为正选择标记；在同源序列之外的3’末端，或3’，5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶HSV–TK基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使载体线性化，然后导入细胞中，进行体外培养，并以药物G-418和GANC作双重筛选。 图2：正负选择载体的筛选原理 Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区； A、B：染色体上的两个基因 E：外源基因； neo：G418抗性基因，即正选择基因；HSK-TK：负选择基因 3. PCR 筛选法