8 植物基因转化.pptVIP

第八章植物基因转化 一、基因工程的流程 二、转化技术 农杆菌介导法 按转移内容分类 种质系统的基因转移 2.几种常用的植物转基因方法 农杆菌介导转化法 基因枪介导转化法 花粉管通道法 显微注射法 体细胞核移植方法 2.1、农杆菌介导转化法 农杆菌是普遍存在与土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌介导转化法 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 2.2、基因枪介导转化法 利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 3.3、花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉通道法培育出来的。 花粉管通道法的优点 花粉管通道法最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 花粉管通道法是由我国生物化学家周光宇首先创立的。 七十年代末结合我国远缘杂交的成功经验，提出了远缘杂交中存在DNA片段的假设。基于这种理论假设，设计了自花传粉后外源DNA导入方法——花粉管通道法转基因技术。 花粉管通道法是指：授粉后利用花粉管的通道使外源DNA导入植物卵细胞，合子或早期胚细胞的技术。 要解决该技术的不足，在一定程度上要对植物雌蕊的形态结构、受精作用等植物胚胎学的基本知识有个全面正确的了解，可能会对花粉管通道法转基因技术机理的阐明，操作程序的规范化以及提高转化率诸方面提供帮助。 3.3.1 花粉管与花粉管通道 被子植物的受精作用是一个相对长的过程。从传粉到受精可以人为地划分为四个阶段，这四个阶段均与花粉管的生长发育联系在一起。 3.3.1.2.花粉管在花柱中生长 3.3.1.3.花粉管在子房腔内的生长 3.3.1.4.花粉管经珠孔进入胚囊，释放二个精子 薄珠心胚珠：成熟胚囊的卵器与珠孔之间只隔一层珠心表皮细胞 厚珠心胚珠：成熟胚囊的卵器与珠孔之间相隔多层珠心细胞，形成花粉管通道 3.3.2 花粉管通道法转化机理的探讨 龚蓁蓁等人（1988）将其花粉管通道的转化机理归结为棉花受精时所形成的自珠孔到胚囊之间的花粉管通道，外源DNA由此通道进入胚囊。邓德旺等人（1999）认为，外源DNA导入的途径为花粉管外通道，经胎座上部传输组织束中的花粉管外缝隙胎座表面、珠孔、珠心通道进入胚囊。 如果这种推测成立，利用花粉管通道法，从技术上讲，外源DNA溶液的导入部位离胚囊愈近，愈有利于外源DNA的渗入。既然外源DNA导入胚囊是以连续不断的花粉管外表面为依托，为此花粉管必须先形成，而后才能进行外源DNA导入的技术处理。 3.3.2.2 外源DNA转化的受体 外源DNA通过花粉管外表面渗入到胚囊后，其转化受体也有不同看法 大多数作物的受精研究表明精子在助细胞内释放到精卵融合结束大约需要3-10小时左右，而外源DNA的渗入是在花粉管长入助细胞之后发生的，从时间和地点来看，释放的精子与卵细胞的融合在先，外源DNA几乎没有机会转化精子或卵细胞。 而在精卵融合与合子早期，卵细胞和合子的合点端细胞壁尚没有封闭，有利于外源DNA的导入，因此，我们认为外源DNA转化的受体应该是融合期的卵细胞和早期合子。 3.3.2.3 外源DNA转化的受体外源DNA转化受体的时间 根据植物胚胎学的研究资料表明，助细胞、卵细胞在刚刚形成时均有细胞壁包围，而当受精前——即成熟胚囊阶段，助细胞与卵细胞的合点端成为无壁状态或间隔无壁状态，这为精子从破坏的助细胞中释放、与卵及极核的融合提供了条件。合子分裂之