引物设计原则-3.docVIP

引物设计总结 1．寡核苷酸的优化设计 ????在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。????怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。1.?估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性????寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在，大多采用?Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25?℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是： 此主题相关图片如下：4．1?如何测定引物的OD值？????用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 2．?如何检测引物的纯度？????实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。 3．?怎样按照使用浓度溶解引物？????记住几个参数：????在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的溶液定义为1?OD260单位，据此定义，1?OD260引物干粉约为33微克；????碱基的平均分子量为324.5；????引物的分子量=碱基数?x?碱基的平均分子量；????引物的摩尔数=质量数?/?引物分子量????举例：如果您拿到一管标明为2?OD的20碱基的引物，????分子量=20?x?324.5=6490?质量数=2?x?33?=66μg????摩尔数=66?/?6490?=0.010?μmol=?10?nmol????若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。????同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。 4．?如何保存引物？????可以室温或-20℃密闭长期保存；溶解以后的DNA最好保存在-20℃,溶解引物的水的PH值要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。 5．?已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？????如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。 6．?为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？????通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。 7．引物不纯会造成什么后果？????引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。 8．?普通合成的DNA片段5末端是磷酸基团吗？????普通合成的DNA片段5末端与3末端都是羟基，可直接用于PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外收费(参见价目表)。 9.??常用标记的荧光染料的波长、可见光中的颜色? 简称????????全称?????????????????????????????????吸收波长????????????发射波长?????????????????颜色?6-FAM????