生物化学技术原理及应用分析报告.ppt

第五节 荧光分析法 3. 荧光分析法的定性和定量 定性分析： 每种荧光物质在一定条件下都有其特定的激发光谱和荧光光谱，相比只能得到被测物质的一种特征吸收光谱，荧光分析做定性分析时有更高的可靠性。荧光定性分析就是测定样品的两种特征光谱形状和波长范围，再与标准物质进行比较，从而确定待测样品与标准物质是否为同一种物质。 定量分析： 样品溶液的浓度很低，其它条件一定时，荧光强度与样品浓度成正比例关系。 根据荧光强度与溶液浓度成正比的定量关系，在一定的浓度范围内，可采取标准曲线法、比例法、联立方程式法来进行荧光物质的定量测定，方法同分光光度法类似。 * * 南京农业大学 生命科学学院 第五节 荧光分析法 4. 荧光分析法在生物学中的应用 天然荧光物质的应用。天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。 蛋白质的内源荧光。利用蛋白质内源荧光检测蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法。蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。 天然色素的内源荧光分析。维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。还可以利用荧光强度的变化估算出光合效率的高低。 外源荧光物质的应用。由于天然荧光分子种类有限，在生物学和医学的实际中，应用得更加广泛的是荧光探针，即外源荧光技术。目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。 * * 南京农业大学 生命科学学院 外源荧光物质 蛋白质的荧光探针： 共价标记。有些荧光探针可以与蛋白质上特定的基团共价结合，例如胺基和巯基就是蛋白质中容易结合的两种基团。 非共价标记。另外有一些荧光探针可以和蛋白质非共价结合。例如：1,8-ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯）在水中基本不发荧光，但当结合到一些蛋白质上时，可以发出很强的荧光。 利用蛋白质的荧光标记方法，可以研究荧光探针标记的部位微环境的极性、结构、分子运动、结合紧密程度等。也可以利用共振能量转移原理测定基团之间的距离等。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 外源荧光物质 核酸荧光染料（探针）： 吖啶橙（AO）是三环杂芳香环类染料，既可以标记DNA，又可以标记RNA。通过嵌入核酸双链的碱基对之间，这时这种染料的荧光谱与荧光素很相似。 常用荧光探针还有二联苯亚胺，溴化乙啶 EB等等。 * 南京农业大学 生命科学学院 * AO 溴化乙啶二聚体-1标记的肠系膜动脉 荧光技术与其它技术的结合 显微荧光光度技术： 利用显微分光光度计对细胞内的不同成分进行定性、定位或定量的荧光测量与分析，称为显微荧光光度术，又称细胞荧光光度术。用荧光染料标记细胞内的核酸，可以测定细胞内核酸的含量。用荧光探剂标记抗体蛋白，再用标记了荧光探针的抗体与细胞内的抗原作用，即能观察抗原的分布及相对含量。 流式细胞术： 流式细胞术是荧光技术与激光技术、计算机技术结合的产物，是对单个细胞或其它生物微粒（如细菌、真菌、染色体、细胞聚合体等）进行快速定量分析与分选的一种技术。 在分析或分选过程中，包在液流（称为鞘液）中的单个细胞或颗粒顺序通过聚焦的探测光，对细胞或颗粒进行分类和分选；进行这种测量的仪器称为流式细胞仪。（更详细介绍见第十章专题讲座） * 南京农业大学 生命科学学院 * 激光共聚焦扫描显微镜 laser?scanning?confocal?microscope LSCM 图片来自/netshow/SH100953/mostlylist. asp?IMShowNameid=C16712 (激光扫描共聚焦显微镜-北京普瑞赛...) 一、LSCM的特点 利用激光作为光源 在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置 通过针孔的选择和PMT（光电倍增管）收集 带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。 与传统光学显微镜相比，具有更高的分辨率， 实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象 等优点。 二、LSCM的组成 显微镜光学系统 扫描装置 激光光源 检测系统 整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。 1、LSCM的光学系统 　显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插入光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。 2、LSCM的扫描装置 LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度快，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统