单克隆抗体制备方法(全)(精选).docVIP

单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后　　取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫 1×107/0.5ml ip4 G+ X7 ↓2～3周后 第二次免疫 1×107/0.5ml ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓9 取脾融合 T细胞融合 细胞融合前准备 . 骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。 用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系 名称 来源 耐药 Ig链 H L P3/X63-Ag8(X63), j: I7 M) z* ?# P I6 R! n BALB/C骨髓瘤MOPC-210 h! f. {8 y7 |5 Y??A/ Q??E) K( H??N3 ` 8-氮鸟嘌呤9 P p. E, w( W3 p) J- W8 R | r1 　K / O9 G- {+ j% Y5 J7 F4 p P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) E1 ?5 V u; f6 Y6 R L# V3 O2 i P3/X63-Ag86 N/ Q( J$ w3 `3 h8 ~; B: Z$ G 8-氮鸟嘌呤 q i- N5 M. H???( p$ S; e9 J － ( O1 v Z3 D a6 d! g??V8 E－8 r5 Y9 ^: M2 B \0 ~6 Q P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1). Y+ V+ D; Z6 p N9 @1 d T; c y P3/X63-Ag83 f# t; Q$ b* n??E3 @/ y+ O c 8-氮鸟嘌呤* B6 {6 j9 o??]( h, S- H0 W － K（不分泌型） 7 ]. L) O??a [6 |/ W P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul) + X0 Y e8 ~, m4 s （X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤??p; ?+ m7 D+ h. g9 W! A5 f2 I 8-氮鸟嘌呤 8 X5 H#