基因工程(李立家)小题目及答案详解.docVIP

基因工程试题及答案 1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。 1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation) 2）随机引物标记: 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。 3) PCR标记: 针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针 4）末端核苷酸转移法: P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。 补充： 常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛 应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源） 2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。） （1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液） （2）PCR技术的原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。双链DNA在高温时也可以发生变性解链，随即退火使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，之后在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则进行子链的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，在很短的时间内特异性的快速扩增DNA片段。 (3) 克隆过程： A、设计合适的引物，大小在15-25个核苷酸之间，两个引物与模板的结合点之间要包含需扩增的片段的序列，而且引物中要含有合适的酶切位点。 B、根据引物和目标片段的性质，设定各步骤反应的温度和时间进行PCR，扩增目标片段。 C、用琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，并回收目标片段。 D、用相同的（或者能够得到相同末端的）限制性内切酶对PCR获得的目标片段和选择的载体进行酶切，之后将片段和切开的载体放置在同一EP管中，加入T4连接酶进行连接。 E、用普通钙转或者电转的方法将连接产物转化至大肠杆菌中。 F、根据载体含有的性质，选择合适的筛选标记选出转入载体的菌株。 G、若基因片段无明显筛选标记，则可通过将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测、菌落PCR或者DNA探针杂交的方法检测载体上是否含有目标片段，排除空载体的干扰。 (4)PCR技术的应用 A、基因组DNA PCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆 B、基因组的RAPD(随机扩增多态DNA分析，random amplified polymorphic DNA)标记分析。使用随机的短核苷酸引物，在低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的带型，反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。 C、临床诊断和法医鉴定。如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个精子作遗传学鉴定等。 3.转基因动物的安全性问题 正面观点： （1）转基因工程是不可阻挡的.基因工程将影响当代重大的环境问题:人口过剩/污染/生物多样性急剧减退等等.保护土壤/水/能源成为发展可持续农业的目标。 （2)转基因食品的功效: 改良植物的食用品质；增加果蔬贮藏、保鲜性能；生产特殊食品——食品疫苗。 （3）迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。如果转基因生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀。 反面观点： 转基因的潜在危害：转基因动植物安全性评价主要集中在环境安全性，食品安全性以及对人动物健康的影响三方面。 环境安全性分析包括： （1）生存竞争性：转基因植物在生存竞争方面具有的优势可能导致生物多样性的减少，影响了生物多样性； （2）生殖隔离距离:基因不可控制的水平转移的可能性；与近缘野生种的可交配性：外源基因是否会漂流扩散至亲缘野生种中，从而破坏自然生态平衡； （3）对非靶生物的影响