多能干细胞相关载体及其安全性的研究进展-副本详解.doc

研究生课程论文 多能干细胞相关载体的研究进展 授课教师 庞 全 海 2013 级 硕士 研究生 卢杰丽 学 号 多能干细胞相关载体的研究进展 摘要：目前人类已能将鼠和人的体细胞，通过转导Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等基因成功改造成诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPS cell），这使再生医学领域的研究成为热点。尽管目前诱导多能干细胞的临床应用及载药材料的研究仍面临着诸多技术问题，但随着诱导技术和载体种类的不断改进，诱导多能干细胞的临床应用指日可待。文章综述诱导多能干细胞在载体方面的最新研究进展。 关键词: 诱导多能干细胞；病毒载体诱导；质粒载体诱导；酶切系统诱导；重组蛋白诱导；诱导效率 2006年日本京都大学的Takahashi等[1]首次报道，将选择的特定外源性转录因子导入小鼠的成纤维细胞，可以成功诱导出多能性的类胚胎干细胞，他们把这类细胞命名为---诱导多能干细胞（iPS cell）。这一新的突破在理论上首次证实了已分化成熟的体细胞同样可以被重编程而转化为类胚胎干细胞，且成功地解决了难以突破的伦理及免疫排斥问题，为再生医学增加了一个新途径。运用此重编程技术能从特定疾病的患者体内提取成体细胞，进而诱导成疾病特异蚤孕杂细胞。疾病特异蚤孕杂细胞的诱导成功更为体外研究遗传疾病发生、发展和组织形成提供了更加广泛和大量的研究模型，并将有力推动基因治疗和药物研发。但是，重编程外源基因组及使用病毒载体会影响ips细胞基因组，即可能引发潜在的插入性肿瘤和干扰诱导多能干细胞分化。因此，寻找合适的载体是诱导多能干细胞技术的重要研究课题。载体是由质粒、噬菌体及病毒衍生而来的，具有携带功能的DNA分子，在载体中可插入外源基因片断，通过转化、转染或利用病毒进入细胞的机制导入到一个宿主细胞中，并在其中进行复制或表达。 1 使用病毒载体诱导ips细胞 1.1 以逆转录病毒和慢病毒为载体 2007年Okita等[2]报道，以逆转录病毒为载体，将Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等4种因子导入人类成纤维细胞，成功诱 导成类胚胎干细胞。几乎与之同时，美国科学家Yu等[3]也成功地将人类成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞。与Okita研究组所不同的是，Yu等运用的载体为慢病毒，所采用的转录因子是通过自筛而确定的4种因子组合，即Oct3/4，Sox2，Nanog和Lin28。结果显示，生成ips细胞与人的类胚胎干细胞特性高度一致。随后，研究小组将ips细胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚层细胞的畸胎 瘤，进一步证实其具有类似胚胎干细胞的发育潜能。使用逆转录病毒或慢病毒作为载体转染体细胞诱导成ips细胞的方法，因其直接使外源性基因和载体整合到受体体内的基因组，会引起插入突变以干扰正常的ips细胞系的功能，而细胞中残余的外源因子序列的表达会影响分化，甚至有导致肿瘤发生的危险性。特别是原癌基因c-Myc的导入，由其构建的嵌合体小鼠中约20%发生了肿瘤[3]。因此，目前很多学者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的转导，而以逆转录病毒和慢病毒为载体诱导ips细胞的临床应用也受到了极大的限制。 1.2 以腺病毒为载体 2008年Stadtfeld等[4]报道，使用腺病毒载体转染Oct4，Sox2,ccc-Myc和Klf4种因子，成功地将小鼠肝细胞改造成ips细胞。研究者使用聚合酶链式反应和Southern blotting等方法未发现腺病毒载体基因组及转导因子基因组整合到宿主细胞基因组中的迹象。与逆转录病毒、慢病毒相比，腺病毒载体可以使外源基因组不会整合到宿主细胞基因组当中，解决了外源基因组对ips细胞分化干扰的难题。然而，以腺病毒为载体诱导ips细胞的效率非常低（0.0001%-0.0018%），比逆转录病毒为载体的诱导率（0.1%）低很多，这就 限制了其临床应用。 2 使用质粒载体诱导ips细胞 2.1 以质粒为载体 2008年日本学者Okita等[5]使用质粒为载体，携带转染所需的因子基因，成功地将小鼠成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞---ips细胞。这种方法不仅防止了病毒载体基因组整合到宿主细胞基因组中，同时可以防止外源基因干扰ips细胞的分化。Okita等利用质粒的自我复制和转录等特性设计了两种携带转染因子的质粒改造小鼠成纤维细胞，一种为pCX-OKS-2A，其由一段2A肽（ 来自口蹄疫病毒，具有自我清除作用）携带Oct4,Sox2和Klf4三种转导基因；另一种是pCX-c-Myc，由一段2A肽携带c-Myc转染基因。两种质粒