土壤酶活性测定(精选).docVIP

土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008 过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413） 关松荫/土壤酶及其研究法 农业出版社 1986年七月第一版 蔗糖酶274-276 土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法 （一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。 （二）试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：用水稀释至。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将溶液各20混合，用蒸馏水稀释至100。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液 （三）测定步骤 （1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液mL，定容至100mL，，吸取 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 土壤中脲酶活性的测定以每克土壤在24h内酶解释放的NH3-N 的表示活性 二. 过氧化氢酶测定 容量法 1. 试剂配制 a. 0.3％过氧化氢溶液：将10ml 30%的过氧化氢用水稀释至1L，此溶液不稳定，需临时配置。 b. 1.5mol/L 硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100ml c. 0.002 N KMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾0.3161g，溶于1升蒸馏水中，贮于棕色瓶中，备用。如果知道酶活性很高的话 可以适当变化高锰酸钾浓度 2. 操作步骤 （1）取5g过1mm风干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。 （2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。并作无土对照。 （3）将三角瓶放在振荡机上振荡（120r/min）30min后，加入5mL 1.5mol/L硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.002N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点（30s不退色）。 3. 结果计算 以单位土重消耗的0.002moi/l高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢酶活性，其计算式为土壤过氧化氢酶活性（ml KMnO4/g干土） V/dwt 式中，V为0.002mol/L高锰酸钾毫升数（ml）；dwt为烘干土壤重量（g）。 用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。 （A-B）×T即为过氧化氢酶活性 高锰酸钾溶液标定 吸取2ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入几粒玻璃珠，再加5ml1:3的硫酸酸化，在电炉上加热2min，取下稍冷，趁热（70-80度）用高锰酸钾溶液滴定，滴至为红色（30s不退色）即达到终点，记下高锰酸钾的毫升数（V）。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算 c（1/5KMnO4） m/（V1-V2）*0.06700 式中 c（1/5KMnO4） —高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L； m——草酸钠之质量，g； V1——高锰酸钾溶液之用量，mL； V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL； 0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4） 1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。 土壤磷酸酶测定磷酸苯二钠 磷酸酶 phosphatase 能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。 （一）基本原理 pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用pH 5.0的乙酸盐缓冲液）。 （二）实验试剂 1．酶促反应试剂 1 甲苯。 2 苯磷酸二钠溶液：将6.75g苯磷酸二钠溶液 C6HP04Na2·2H20 溶于水，并稀释至mL（mL含25mg酚）。 3 乙酸盐缓冲液 pH 5.0 ：称取136g乙酸 C2H302Na 溶于700mL去离子水，用乙酸调节至pH，用去离子水稀释至lmL。 4 柠檬酸盐缓冲液