内毒素检查课件.ppt

供试品细菌内毒素检查 例 某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。 MVD=CL/λ=0.5/0.125=4 将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。 供试品 供试品阳性对照 阳性对照 阴性对照 – – + + + + – – 结果是否有效 有效 结果判断 该葡萄糖注射液内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定。 注意事项 1、鲎试剂灵敏度复核。 鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，故药典要求在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验，其意义在于：1、验证鲎试剂灵敏度是否准确，2、考察实验室条件，3、考察实验人员操作技能，4、验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。 2、细菌内毒素标准品 标准品溶解后一定要在旋涡混合器上混合15min，以后每一步稀释至少混合30S，否则可能会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确的实验结果。 注意事项 3、BET水 BET水是一种特殊的灭菌注射用水，根据药典要求细菌内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法），而且严格要求pH值为6.0～8.0，绝不能用注射用水代替使用。 4、检查法中的各种对照 在进行常规细菌内毒素检查时，规定了阳性对照，阴性对照及供试品阳性对照，阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度是否符合规定，阴性对照的目的是证明所用的BET水中不存在可被检测到的内毒素，供试品阳性对照的目的是证明在试验条件下被检测的供试品保证不存在抑制因素，在进行常规细菌内毒素检查时，以上各种对照应同时进行。 结束，谢谢！ 细菌内毒素检查 目录 1、实验原理 2、实验试剂 3、试验器具 4、检查方法概述 5、供试品溶液的制备 6、内毒素限值的确定 7、最大有效稀释倍数（MVD）的确定 8、鲎试剂灵敏度复核 9、干扰试验 10、供试品的细菌内毒素检查 实验原理 利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 阳性结果 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 实验试剂 鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 实验试剂 细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。 细菌内毒素工作标准品 系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 细菌内毒素检查用水 指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。 试验器具 刻度吸管、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。 耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品 ）。 试验准备 1、清洗干净的玻璃容器、注射器、镊子、剪刀等放入金属制容器内密闭加热去热原，达到时间后，关闭电源。待烤箱温度自然降低至室温，在不开启金属容器的情况下，可一周内使用，否则必须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。 2、塑料制品清洗干净后在30%的双氧水中浸泡4H，再用无热原水充分冲洗后在60 ℃烘箱中烘干备用，一般我们会把枪头装入盒中进行湿热灭菌。 3、试验前应先把水浴锅或恒温器温度调到37 ℃ ±1 ℃。 检查方法概述 凝胶法 限量试验 半定量试验 光度测定法 浊度法（终点浊度法和动态浊度法） 显色基质法（终点显色法和动态显色法） 凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法 对干扰相对不敏感。 较光度测定法不灵敏 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0 的范围内。 可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。 内毒素限值的确定 一般按公式： L=K/M 式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示。 K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂K=5EU/（kg·h），放射性