层析技术分离生物大分子(凝胶过滤).pptVIP

层析技术分离生物大分子 1、定义 层析分离是一个动态过程，它是由一个移动相（移动着的气体或液体）对另一个固定相（不移动的固体或液体）作相对连续移动，移动相里含有要分离的混合物质，在移动过程中，各种溶质受到固定相不同程度的作用，达到分离。 2、分类： 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 聚焦层析 层析技术分离生物大分子 一、原理 分配系数 Ve – Vo Kav= Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 Ve= Vo Kav=0 分子量中 Ve= Vo+ KavVi 0 Kav1 分子量小，进入内部 Ve= Vo+ Vi Kav=1 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 二、实验流程及方法： 制备固定相（装柱） →平衡→上样→洗脱→收集→检测 实验操作 1、凝胶的溶胀 称取7g Sephadex G-75 于250 mL烧杯中加入洗脱液100mL，置于室温溶胀2-3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2-3小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。（此部分已经完成） 使用时在超声波中超声10分钟。 2、装柱 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积1cm-2cm高度后打开出水口，流速一般用3-5mL/10min（预先恒流泵调好，记录流速）。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1-2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在最后走样品后,距离胶柱上端作一个记号，回收凝胶，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。 3、V0和未知蛋白Ve的测定 吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，可覆盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用移液枪吸取0.25ml（5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白（10mg/mL）的混合液，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开恒流泵（开始收集！），待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3-5mL/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为10min每管。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0，至第二个最高点为Ve。注意：蓝色葡聚糖及未知蛋白洗下来之后，还要用洗脱液（1-2倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。 4、标准曲线的制作 （1）用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中二种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（10mg/mL）、溶菌酶蛋白（10mg/mL）。 按（3）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5mL，以3-5mL/10min的速度洗脱并收集洗脱液。 同时用核酸蛋白检测仪测定A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后计算出两种标准蛋白的洗脱体积Ve。 5、以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱曲线。（电脑画出） 6、以Kav为横坐标，LogMr为纵坐标作标准曲线。 在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待测定蛋白质的分子质量。 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。 图例： * * 思考：SDS和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有何不同？ *