使用ionKey2解读.doc

使用ionKey/MS系统提升人血浆中治疗性内源性多肽的定量检测方法的灵敏度、减少样本量 应用优势 高灵敏度的定量限小于1 pg/mL，仅需100 μL血浆样本量 使用ionKey/MS，样本量仅需25 μL，检出限就可以达到2.5 pg/mL 使用混合模式的故乡萃取SPE技术进行前处理，减少了基质的干扰，提高了血浆提取的选择性iKey减少了40倍的溶剂消耗，节省了极大的成本 沃特世解决方案 ionKey/MSR系统 ACQUITY UPLCR M-Class IonKey?源 XevoR TQ-S质谱仪 iKey? 分离装置 OasisR WCX 96孔μElution板 ACQUITYR采集板 MassLynx? v. 4.1 关键词 生物分析，生物分析，Oasis，样品配制，肽定量，去氨加压素，血管加压素，奥曲肽，UPLC，二维技术，血浆，ionKey/MS，iKey 介绍 近年来使用肽和蛋白质作为治疗药物显著增加因此,对毒性动力学和药代动力学））μElution混合型SPE进行样品前处理，选择最佳的MS母离子和碎片离子，ionKey/MS/系统（离子源如图1所示），这样就可以达到血浆中1 pg/mL的定量限。利用ionKey/MS系统有助于将所需血浆样本的量减少到25-100 μL。 实验 方法条件 UPLC条件 系统： ACQUITY UPLCR M-Class，捕集器和反冲洗 洗脱配置 设备 色谱柱： HSS T3，1.7 μm，130 A, 150 μm×50 mm iKey （p/n 720007261EN） 捕集色谱柱：ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18, 5 μm, 300 μm x 50 mm (p/n 720007498EN) 流动相A： 0.1%甲酸水 流动相B： 0.1%甲酸乙腈 上样溶剂： 98:2流动相A:B， 25 μL/min持续头2分钟， 阀切换 阀位置： 初始位置1（上样至捕集 器），在2分钟时改为位 置2（反冲洗洗脱捕集器 到分析色谱柱上） 分析梯度： 见表2 洗脱流速： 3.0 μL/min 色谱柱温度： 75 ℃ 样品温度： 15 ℃ 进样体积： 5 μL 总运行时间： 12.0分钟 采集板： 沃特世1 mL ACQUITY采集板 质谱条件 系统： Xevo TQ-S 离子化模式： ESI正离子 毛细管电压： 3.8 kV 源温度： 120 ℃ 锥孔反吹气流量： 100 L/ hr 碰撞池压力： 5.5×10(-3) mbar 碰撞能量： 按成分进行优化，请参见表3 进样锥电压： 按成分进行优化，请参见表3 数据管理 谱图软件： MassLynxR 4.1 定量软件： TargetLynx? 表 1. 肽的化学性质 肽 氨基酸序列 质荷比 等电点 HPLC指数 奥曲肽 8苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-ol（二硫键2-7） 1019 9.3 40.8 去氨加压素 Mpa-酪氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基（二硫键1-6） 1069 8.6 16.8 血管加压素 半胱氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基（二硫键1-6） 1084 9.1 7.6 梯度 时间（分钟） 组成%A 组成%B 曲线 0.0 98 2 6 5.0 50 50 6 5.5 50 50 6 7.0 10 90 6 8.0 10 90 6 9.0 98 2 6 表2.液相梯度条件 图1.ionKey离子源 样品配制 样品前处理 100μL人血浆1:1比例与4%磷酸水溶液混合稀释。 实验Oasis WCX阳离子固相萃取来提取样品 前处理后的血浆样品按照表2的方案进行提取。所有溶液全部定量。所有提取样品步骤都用μElution孔板完成。 Oasis WCX mElution方案 零件编号：186002499 200 μL 甲醇 平衡： 200 μL 水 上样： 200 μL预处理血浆 洗涤液1： 200 μL 含5% 氨水水溶液 洗涤液2： 200 μL 含10% 乙腈水溶液 洗脱液： 2×25 μL 含2% 甲酸的50:50 乙腈水溶液 稀释： 50 μL 水 图2.Oasis μElution WCX萃取方案。 结果和讨论 质谱 去氨加压素的2+前体（质荷比 535.45），血管加压素（质荷比542.75）和奥曲肽（质荷比510.30）用于定量。它们对应的碎片和最佳质谱条件如表3所示。在该分析中，由于该肽分子小，有内源性，因此使用高度特异性的b或y离子碎片的方法更有挑战性