现代生物学进展.docx

王立安：电泳技术原理一、概述电泳：指带电胶粒或大分子在外加电场中，向着与其电荷相反的电极做定向移动的现（electrophoresis EP）。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所处介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。1808年?Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法（moving boundary EP），将血清蛋白分为了5个组分，并于1948年荣获诺贝尔奖。20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。长期以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以期实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。目前，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。1. 电荷来源物质带电是一普遍现象。任何物质由于其自身的解离作用或表面上吸附其他带电质点均表现带电。两性电解质的带电与pI有关。如氨基酸、蛋白质、核酸。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。后来出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳，减少了扩散和对流等干扰作用。2. 支持介质最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。电泳槽根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽 Tiselius设计的自由界面电泳槽，是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。但90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。(2)管状电泳槽 50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。(3)板状电泳槽板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样