实验六微生物的大小测定和显微直接计数解决方案.ppt

实 验 六 微生物大小测定和显微直接计数 * 一、实验目的 学会测微尺和血球计数板的使用方法。 建立微生物大小的概念。 * 二、基本原理 1.微生物大小的测定原理 微生物的大小需要用刻有一定刻度的测微尺来测量，先用绝对长度的镜台测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。 * (1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。刻度的大小是随使用的接目镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用镜台测微尺来标定。 (2)镜台测微尺的构造 镜台测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm。 * * 目尺每格长度= 两个重叠刻度间镜尺格数×10／两个重叠刻度间目尺格数 * 2.显微镜直接计数原理 微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。 前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。 后者是在平板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。 本实验是利用血球计数板进行直接计数。 计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。 * 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格为边长为1mm正方形，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。 * * 16小格 × 25中格计数室 25小格 × 16中格计数室 计数室的两种刻度形式 * 计算公式 (1)16小格×25中格的血球计数板计算公式： 细胞数／ml=A／5×25×104×B (2)25小格× 16中格的血球计数板计算公式： 细胞数／ml=A／5×16×104×B 其中： A为五个中方格的总菌数 B为稀释倍数 * 三、实验器材 菌种：酿酒酵母。 仪器或其他用具：细菌三型玻片标本；显微镜；血细胞计数板，盖玻片；镜台测微尺，目镜测微尺，载玻片；无菌毛细滴管。 * 四、实验步骤 1.酵母菌大小的测定 （1）目镜测微尺的校正（高倍）? 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。 先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合。 定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。 * （2）酵母菌大小的测定 取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸制片。 测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。 在同一标本上测定5-10个菌体，求其平均值。 2.细菌大小的测定 （1）目镜测微尺的校正（油镜）? （2）细菌大小的测定 测定细菌三型玻片标本上的某一种细菌（球菌或杆菌 或螺旋菌） * 2.酵母细胞数的直接测定 （1）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片（盖玻片要清洗）。 （2）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 （3）加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。 * 一般样品稀释度要求每小格内约有4-5 个菌体为宜。 每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。 位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。 如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。 计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。 （4）清洗血细胞计数板 使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。 通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。 * 五、实验结果 1、微生物大小测定实验结果 （1）将目镜测微尺校正结果填入下表： 接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格代表的长度(μm) 高倍镜 油 镜 接目镜的放大倍数________ （2） 微生