常温组织RNA提取详解.docVIP

常温组织RNA提取注意事项 背景知识?高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物，其它绝大部分样品的RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。　RNA抽提的问题，简单可归纳为三个：降解、纯度、得率。判断这三个指标的基本手段是：电泳和紫外分光光度仪。降解只能通过电泳判断；纯度和得率主要使用紫外分光光度仪检测，但电泳也可以提供简单参考。要正确解读电泳或者紫外分光光度仪的结果，首先就要对这两个方法有基础的了解。　如果抽提基因组DNA的最大问题是纯度，那么，抽提总RNA的最大问题是降解。降解主要来自两个方面：样品的内源酶的作用和最后溶解用水及离心管的不干净。对大部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织RNA的抽提，总会碰到问题呢？ 　组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触并被及时裂解，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质–用嘴碾磨，肠胃抽提。 　基因组DNA残留，是一个容易被厂家糊弄的概念。如果你判断基因组 DNA是否残留的标准是电泳，那么，许多产品都可以做到“无基因组 DNA残留”。这时，你需要问一下：基因组 DNA残留影响的后续实验主要是什么？是 PCR。理论上，PCR的灵敏度是一个分子，也就是 pg级的 DNA残留；电泳可以看见 DNA条带的极限，则不小于 ng级。电泳看不见 DNA残留的意义是，DNA残留少。实践证明，无论是 TRIzol方法、柱离心式方法、甚至包括柱内 DNase I消化 DNA的方法，都无法确保彻底去除 DNA；真正能彻底去除 DNA残留的方法，只有液体体系下 DNase I的消化。　实验前的准备　究竟怎样才能确保RNA抽提的成功率呢？实验前的准备是非常重要的。首先，要了解你的实验室环境，了解你的实验环境中可能存在的隐患：是否有同事在进行DNA抽提？是否实验室人员众多？第二，要了解你可以使用的设备：离心机是否可以低温操作？破碎、匀浆的条件怎样？第三，要了解抽提RNA的目的。第四，要了解样品的采集、制备、保存的条件，了解样品的特点。在对上面四点有了充分的了解后，才能正确选择合适的方法/试剂，提高抽提的成功率。　选择合适的方法/试剂，这是非常重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。　0：抽提RNA的目的　RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的RNA为目的，劳民伤财。　1：样品的收集