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NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T674—2003 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 Detection of Genetically Modified Plant Organisms and Derived Products – DNA Extraction and Purification 报批稿 2003-04-01发布 2003-05-15实施 中华人民共和国农业部 发布 前 言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准起草单位：中国农业科学院生物技术所、中国农业科学院植物保护研究所、上海市农业科学院、农业部科技发展中心、中国农业大学。 本标准主要起草人：贾士荣、金芜军、张大兵、彭于发、黄昆仑、李宁、汪其怀、罗云波。 本标准为首次发布。 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 1 范围 本标准规定了转基因植物及其产品中DNA提取和纯化的方法和技术要求。 本标准适用于转基因植物及其产品中DNA的提取和纯化。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样 3 原理 通过物理和化学方法使DNA从样品的不同组分中分离出来。利用不同的纯化方法，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其它次生代谢物，及DNA提取过程中加入的氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇和乙酸钠等，获得纯化的DNA。 4 试剂与溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂；配制好的溶液经高温灭菌后使用。 4.1 溴代十六烷基三甲胺（Cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB）。 4.2 三羟甲基氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris）。 4.3 二水乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate, EDTA-Na·2H2O）。 4.4 (-巯基乙醇（(-Mercaptoethanol）。 4.5 氯仿（Chloroform）。 4.6 异戊醇(Isoamyl alcohol)。 4.7 异丙醇(Isopropyl alcohol)。 4.8 氯仿+异戊醇=24＋1(v+v)。 4.9 76%乙醇溶液：取760 mL无水乙醇，加水定容至1 L。 4.10 70%乙醇溶液：取700 mL无水乙醇，加水定容至1 L。 4.11 CTAB提取缓冲液I：配制每升CTAB提取缓冲液I，应在800 mL去离子水中加入46.75 g 氯化钠，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入50 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) (在800 mL去离子水中溶解121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0（约需42 mL浓盐酸），加水定容至1 L，分装后高压灭菌)，20 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) (在800 mL水中加入186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH）调节溶液的pH值至8.0（约需20 g NaOH颗粒）然后定容至1 L，分装后高压灭菌)，用水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.12 CTAB提取缓冲液II：配制每升CTAB提取缓冲液II，应在800 mL去离子水中加入46.75 g 氯化钠，20 g溴代十六烷基三甲胺(CTAB)，摇动容器使溶质完全溶解，然后加入1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 50 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 20 mL，用水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.13 乙酸钠溶液：配制每升乙酸钠溶液，应在800 mL水中溶解408.1 g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至 5.2，加水定容至1 L，分装后高压灭菌。 4.14 RNase A：将10 mg胰RNA酶溶解于987μL水中，然后加入1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 10