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细胞培养基本操作 创新中心药理组 2008.05 主要内容 细胞培养基本概念 常用设备及条件 无菌操作 器械清洗消毒 细胞培养用液的配制与消毒灭菌 细胞培养基本操作 细胞培养室规章制度 常见污染及防预措施 基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。 培养细胞的生长方式:分为贴附型与悬浮型两大类。 贴附型细胞:是必须贴附于底物才能生长的细胞。包括正常细胞及肿瘤细胞，如：成纤维细胞、骨骼组织、心肌与平滑肌、肝、肾、肺、皮肤、内分泌细胞、神经胶质细胞等以及肿瘤细胞。 悬浮型细胞：不需要附着底物而在悬浮状态下生长的细胞。包括一些取自血液、骨髓、脾脏的细胞。 如：白细胞、一些肿瘤细胞。多呈单个细胞，也有聚集成团。 体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制的传代和生长。 细胞培养常用设备及实验条件 培养室的设备： 紫外灯、空气净化系统、离心机、超净工作台、倒置显微镜、培养箱、水浴锅、4℃冰箱。 水纯化装置、酸缸、烤箱、高压灭菌锅、电子天平、PH计、磁力搅拌器、液氮罐、低温冰箱（-80℃）、酶标仪、微孔板震荡器。 起净工作台使用注意 培养箱使用注意 培养器皿及耗材 培养皿、培养瓶、培养板、滴管、移液管、吸头、滤器、冻存管、烧杯、量筒、加样槽、玻璃瓶、离心管。 手术器械：手术剪（直剪、弯剪）、镊子。 加样枪 单道（5000ul、1000ul、100ul、10ul） 多道（50-300ul） 无菌操作 一、无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。 3.实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟。 4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、倒置显微镜的载物台。 二、实验人员的无菌准备 1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、换好拖鞋。 3.用75％酒精棉球擦净双手。 三、操作注意 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌。 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在碰不到处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到物品。 ６.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。 7.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 8.实验过程中避免交谈。 器械清洗消毒 一、新的玻璃器皿的洗消 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：20-30分钟。 7.高压消毒后烘干。 二、旧的玻璃器皿的洗消 1．浸泡、刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿用清水简单冲洗后可直接泡入８４消毒液及洗涤剂溶液中至少一天，再用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。 三、金属器械洗消 　　金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。 四、橡胶和塑料 １、橡胶和塑料制品通常处理方法是： 　　　先用８４消毒液和洗涤剂浸泡一天，洗刷干净，再分别用洗涤剂和自来水加热超声，再用自来水和蒸馏水冲洗，晾干。 最后装入铝盒内高压消毒