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专题一 基因工程 ·最新考纲1．基因工程的诞生 Ⅰ 。2.基因工程的原理及技术 Ⅱ 。 一、基因工程的基本工具 1．限制性核酸内切酶 1 来源：主要从原核生物中分离纯化而来。 2 作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 3 结果：产生黏性末端或平末端。 2．DNA连接酶 1 作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 2 类型 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 连接黏性末端 连接黏性末端和平末端 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 3.载体 1 常用载体——质粒 2 其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。 深度思考 如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，则图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序如何？ 提示　限制性核酸内切酶能将DNA分子切割为DNA片段，符合图中①；DNA聚合酶在DNA复制过程中将脱氧核苷酸连接成DNA链，符合图中④；DNA连接酶能连接不同的DNA片段，符合图中②；解旋酶能打开DNA双链形成DNA单链，符合图中③。故正确顺序应为①④②③。 二、基因工程的操作程序 1.—2.—组成 3.—方法 4.—深度思考 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。 请据图分析： 切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？请说明理由。 提示　由题图及题干信息知，目的基因两侧分别含—GGATCC—序列和－GATC－序列，若使用酶Ⅰ切割，只能切断一侧，不能切断另一侧，若使用酶Ⅱ切割，则可同时切断两侧，从而切出目的基因，同理，质粒中也含两种酶识别位点，且两识别位点均位于标记基因部位。若使用酶Ⅱ切割质粒，则可同时破坏两个标记基因，使用酶Ⅰ切割则可保留Gene Ⅰ作标记基因，故切割目的基因应选择酶Ⅱ，切割质粒应选择酶Ⅰ。 1．基因工程的基本原理和理论基础概括 如下图 2．限制酶选择的注意事项 1 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶 但要确保质粒上也有这两种酶的切点 。 2 根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 易错警示！　基因工程操作基本工具的8个易错点 1 限制酶是一类酶，而不是一种酶。 2 限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 3 在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 4 将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。 5 不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 6 限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。 7 基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 8 基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。 基因工程操作的基本步骤 1．目的基因的获取 目前有两种途径：一是直接提取目的基因，如从基因文库中获取。二是人工合成目的基因，常用的方法有化学合成法和反转录法。 2．基因表达载体的构建 1 基因表达载体的组成 2 构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 细胞类型 常用方法 受体细胞 转化过程 植物细胞 农杆菌转化法 体细胞 将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上 动物细胞 显微注射技术 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物 微生物细胞 Ca2＋处理增大细胞通透性 原核细胞或酵母菌 用Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收 4.目的基因的检测与鉴定 　、基