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rtpcr实验步骤 篇一：RT-PCR实验步骤 RT-PCR实验步骤 一、总RNA提取 1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。 2. 震荡30s。 3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000×g，4离心，15min。 5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20，30min。 7. 12000×g，4离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀 8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。 9. 7500×g，4离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。 11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70保存。 二、逆转录合成cDNA第一链 反应体系如下 混匀快速离心一次 反应条件如下 -20 冰箱冻存 三、PCR反应 混匀快速离心一次 反应条件如下 PCR产物-20冰箱保存 取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。 100mA 30min溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。 RT-PCR实验方法总结1,2 RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？ 问题： 在 做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出(转 载于:wWW.cSsYq.cOM 书业网:rtpcr实验步骤)我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得 到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5，3RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应 考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。 3.RACE 我 做过RACE（3RACE是宝生物的Kit；5RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3RACE时却怎么也P不出来，这两个基因 是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3UTR太 长的缘故，我都快绿了，有无 RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。 有关内参： RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。 问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？ 答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the templatelt;(for R