葡萄糖苷酶产生菌株的筛选(精选).docVIP

产葡萄糖氧化酶霉菌的选育及发酵条件优化 试验方法： 一、葡萄糖氧化酶的产生菌霉菌的筛选与鉴定 预处理：取1g混合土壤于倒入带玻璃珠的99ml无菌水的无菌三角瓶中，使土样充分打散。 富集培养：将土壤悬液分别稀释至10-4、10-5、10-6 ，并分装于若干只装有PAD培养基的三角瓶中，28 ℃中培养48h，不同稀释度分别涂布平板培养。 初筛：挑选出所需菌株于斜面培养基培养，并显微观察菌株，初步筛选出所需菌株。 直接制片观察法：滴一滴乳酸石碳酸棉蓝染液于载玻片上，用镊子从所筛出的菌株PAD平板培养物中取菌丝，先放入50%乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，用低倍镜镜检。 复筛：向斜面菌种中加入无菌水，洗下孢子接种于种子培养基中，于30 ℃、110r/min摇床培养2h。按5%的接种量接种于发酵培养基中于30 ℃、110r/min摇床发酵7d。提取发酵液中的酶后测定其酶活，筛选出所需菌株。 二、产葡萄糖氧化酶高产菌株的亚硝基胍诱变育种 将筛选得到的葡萄糖氧化酶产生能力最强的菌株活化后接种到液体PAD培养基中，30 ℃、110r/min摇床培养2h。取200μL菌液涂布平板，在平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于28 ℃中培养24h。 增殖培养：挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有20mL 液体PAD培养基的三角瓶中，摇匀，制成菌悬液，同时挑取远离抑菌圈的少许菌苔到另一盛有20mL 液体PAD培养基的三角瓶中，摇匀，制成对照菌悬液，将其置于28 ℃中培养24h。 涂布平板：分别取上述两种培养液的菌悬液200μL涂布平板，置于28 ℃中培养48h。挑取单菌落于斜面培养基中培养保藏。 酶活测定：挑取上述斜面菌体接种于发酵培养基中，于30 ℃、110r/min摇床发酵7d，提取发酵液中的酶并测定其酶活。与出发菌株作比较，筛选出高产菌株。 三、高产菌株发酵条件的优化 通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。 将选出的正突变菌株在培养基中培养12-16h后，将种子瓶中的培养液以5%的接种量分别接种在发酵培养基和不同优化条件的培养基中，发酵48h后，提取发酵液中的酶并测定其酶活，分析确定最佳摇瓶发酵条件。 表2 实验因素与水平 水平 PH值 C源 6g/100mL N源 0.3g/100mL 1 5.0 乳糖 酵母浸膏 2 5.5 葡萄糖 蛋白胨 3 6.0 蔗糖 尿素 表3 不同处理的试验 项目 A B C 酶活 1 1 1 1 2 1 2 3 3 1 3 2 4 2 1 3 5 2 2 2 6 2 3 1 7 3 1 2 8 3 2 1 9 3 3 3 四、酶活力的测定 酶活定义：在pH5.6，温度为30℃条件下每分钟催化1μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶的量为一个酶活力单位U 。 酶活测定方法：Underbofler滴定法，原理是用碱滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的葡萄糖酸。具体操作是取250mL三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸缓冲液pH 5.6 25mL及1mL 酶液，迅速与30℃下振荡1h，然后加入0.1mol/L NaOH溶液20mL使反应终止，用0.1mol/L HCl滴定剩余的NaOH，记录消耗的盐酸毫升数为A；对照样在加酶液之前加入0.1mol/L NaOH溶液20mL，不必振荡，其它操作相同，记录所消耗的盐酸毫升数为B。计算式为： GOD酶活 [ B-A *f*N*1000]/60 μmol/min 式中：N—盐酸浓度 0.1mol/L ，f—稀释倍数 培养基： PDA：马铃薯 200g 马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后 蔗糖（或葡萄糖） 20g 用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补 琼脂 15~20g 足水至1000mL。121℃ 灭菌30min。 水 1000mL pH 自然 斜面培养基：NaNO3 0.2%、 K2HPO4 0.1%、 KCl 0.05%、 MgSO4 0.05%、 葡萄糖 4%、 琼脂 1.5%~2.0%； pH 自然，121℃灭菌30min。 发酵培养基：葡萄糖 6%、 蛋白胨 0.3%、 NaNO3 0.4%、 K2HPO4 0.2%、 KCl 0.05%、 MgSO4.7H2O 0.07%、 CaCO3 1%、 pH 自然，115℃灭菌20min。 试剂： pH 5.6 的磷酸缓冲液（0.1 mol/L）：在80mL蒸馏水中溶解KH2PO4 12.45g和K2HPO4 1.94g，转移至容量瓶中加水定容至1000mL，保存于室温。 5%葡萄糖溶液：在50mL蒸馏水中溶解5.0g葡萄糖，转移