生化实验01-蛋白质含量的测定.ppt

实验01 植物组织中蛋白质含量的测定（Folin—酚试剂法） 一、原理 Folin-酚试剂法（Lowry法）结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。第一步反应：在碱性条件下，蛋白质的肽键与铜结合生成紫红色的蛋白质-铜络合物(双缩脲反应)；第二步反应：此络合物及蛋白质中酪氨酸和苯丙氨酸等的残基使磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关，在650nm下比色测定即可进行定量。 灵敏度高：比双缩脲法高100倍。适用范围：微量蛋白质（0.02～0.50mg/mL）测定。 干扰因素： 酚类、柠檬酸和巯基类化合物等还原性物质。 二、材料、设备与试剂 （一 ）实验材料 ：绿豆芽下胚轴 （二）设备 ：天平；分光光度计；移液器等。 （三）试剂 1. Folin试剂甲——试剂A：试剂B == 50：1 2. Folin试剂乙 3. 标准蛋白质溶液： 250 ug/mL。 三、实验步骤（一）标准曲线的制作 比色测定： 1号管为空白，在650nm波长下用10mm的比色皿测定各管的吸光度。 标准曲线绘制： 以标准蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度（A650）为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线。 （二）样品中蛋白质的提取及测定 0.2～0.5g绿豆芽下胚轴于研钵中 —→加1—2mL水—→研磨成匀浆后定容至25mL —→室温下放置10——20min（间歇震荡） —→过滤后得到待测溶液。 取待测液1.0mL进行测定（参考制作标准曲线的步骤）。 样品中蛋白质的含量（mg/g）＝ 注意事项： 试剂乙在碱性环境中不稳定。 酚类、柠檬酸、还原性糖类等物质有干扰。 * * Designed by XK Wang 0.5mL（逐一加入并立即混匀），20--30min后，测定A650 试剂乙 5mL，混匀后室温下放置5——10min 试剂甲 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 /mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白溶液 /mL 样品溶液 5 4 3 2 1 管号 A650 蛋白质/ μg 0 四、结果计算 （X：根据样品的吸光度所查得的标准曲线值（蛋白质量μg）；VT：提取液总体积（mL）；W：样品鲜质量（g）；Vs：测定时取用的样品体积（mL）；N：样品稀释倍数） * *