10生工基因工程课实验指导.docVIP

基因工程综合实验 2013.5 本综合实验包含的实验内容：质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增，通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 以下为按照内容划分的实验指导： 实验一、碱裂解法提取质粒DNA、质粒DNA的纯化和凝胶电泳分析 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。 二、实验原理 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。 三、实验材料 大肠杆菌DH5α（含重组了约1