家禽新城疫HAHI的免疫监测.doc

实 验 二 家禽具血凝性病毒病的免疫监测 一、实验目的 1.掌握血凝性病毒病免疫监测的基本方法。 2.学会根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群血凝性病毒病免疫接种。 二、实验内容 1.红细胞凝集试验－检测抗原的HA效价及4个血凝单位抗原的配制。 2.红细胞凝集抑制试验－检测免疫禽只的HI抗体。 3.根据血凝性病毒病免疫监测的结果指导鸡群相应病毒病的免疫接种。 三、实验仪器、设备及材料 1.抗原原液：购自标准厂家，根据监测抗体的种类而确定抗原的种类。ND免疫监测―ND抗原；AI H5免疫监测―H5抗原；AI H9免疫监测―H9抗原；EDS－76免疫监测―EDS抗原。 2.被检血清：随机采取被检禽群的血液（抽样比例约为1％～2％，或每个禽群抽取20～40只），取血液自然凝固后析出的血清作为被检血清。 3.灭菌PBS生理盐水，PH7.0，按常规配制。 4.红细胞悬浮液：采取健康公禽（被检测血清为鸡血清时，应采用公鸡，被检血清为鸭、鹅血清时，应采用公鸭）血液（每次可采5～10mL），抗凝，加灭菌PBS生理盐水离心洗涤3～5次（每次离心的速度和时间为3000转/分钟，15分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用灭菌PBS生理盐水稀释成1％悬浮液。该红细胞悬浮液在4℃存放，可用3～5天。注意悬浮液颜色变暗应予弃去。 5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反应板，普通离心机等。 （以下内容主要以ND的免疫监测为例，同学们可依此类推探讨其他血凝性病毒病免疫监测的相关技术） 四、实验原理 鸡群ND免疫后，体内可产生抗ND中和抗体及红细胞凝集抑制抗体（HI抗体）。后者在体外可抑制NDV凝集红细胞的能力。在一系列试管中，将被检鸡血清作连续稀释，血清中HI抗体越高，则能使ND病毒凝集红细胞能力完全抑制的血清稀释度就越高。由于HI抗体与中和抗体的消长是基本一致的，故通过HI抗体水平的检测可以达到ND免疫监测的目的。 五、实验步骤 (一) 红细胞凝集试验（微量法检测ND抗原原液HA效价及配制4个血凝单位ND抗原） 1.分装生理盐水：用移液器在96孔V型反应板的一排孔上的1—12孔，每孔加入PBS生理盐水25uL，换滴头； 2.添加抗原：吸取标准ND抗原原液25uL加入第1孔，换滴头； 3.稀释抗原：用25uL移液器将第1孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第3孔．．．．．．，如此，直至第11孔，从11孔吸取25uL溶液弃去，换滴头； 4.加入PBS生理盐水：向1-12孔加入PBS生理盐水，每孔25uL； 5.加入红细胞悬浮液：向1-12孔加入红细胞悬浮液，每孔25uL； 6.静置感作20-30分钟，然后判定结果； 7.判定结果（观察、判定、记录反应结果的相关概念与方法） ①“凝集”的概念：观察反应孔，当一层红细胞凝集颗粒均匀覆盖于整个孔底，判定为“凝集”（将反应板倾斜，无红细胞流淌现象），记录为“+”。 ②“不凝集”的概念：观察反应孔，当红细胞完全自然沉降到孔底中央，形成一个边缘光滑无凝集颗粒的红圆点，判定为“不凝集”（将反应板倾斜，有红细胞流淌现象），记录为“—”。 ③ND抗原的血凝效价的概念：凡能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释度称为该ND抗原的血凝效价。 ④判定、记录反应结果的方法 判定、记录反应结果时，可绘制一个表格，将试验情况与结果判断作填写。 如下是一个ND抗原原血凝效价测定结果判定与记录的例子，可作模仿。 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 效价 抗原稀析 1：2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 PBS 对照 1：64 反应图像 ● ● ● ● ● ● ⊙ ⊙ ⊙ ⊙ ⊙ ⊙ 结果记录 + + + + + + - - - - - - 8．4个血凝单位（4HAU）抗原的配制方法 依据ND抗原原液的HA效价，用PBS生理盐水将该抗原原液稀析为4HAU抗原（用于下述HI试验）。每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为：该抗原原液效价的倒数除以4减1。如上例，抗原原液效价为1：64，则，每mL抗原原液加入PBS生理盐水的毫升数为64/4-1=15。 （二）红细胞凝集抑制试验（微量法）－检测免疫禽只的HI抗体。 1．分装PBS生理盐水：在96孔反应板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理盐水25uL; 2.向第1孔加入被检血清； 3.稀释被检血清: 用25uL移液器将第1孔中的被检血清与PBS生理盐水吹打2-3次混合均匀并吸取25uL至第2孔；用移液器将第2孔中的抗原与PBS生理盐水吹打2-3次混