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宏基因组 产生背景 人类基因组计划(human genome project，HGP)的完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为主的后基因组时代 人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。 要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究。 宏基因组学 宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用环境样品基因组资源，获得活性物质和功能基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍，可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了微生物资源的利用空间，正成为国际生命科学研究最重要的热点之一 宏基因组学的发展 宏基因组学的发展经历了4个阶段： 环境基因组学 微生物基因组学 宏基因组学 人类宏基因组学的阶段。 环境基因组学 1991年首次提出环境基因组学(environmental genomics)的概念，同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA 的噬菌体文库。 1998年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划(environmental genome project，EGP)，开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究 环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展 微生物基因组学 1998年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组，首次提出针对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这一宏基因组(metagenome)概念 2007年3月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学—— 揭示微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，是对微生物世界认识的革命性突破 宏基因组（广义） 广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学 宏基因组（狭义） 狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律 人类宏基因组学 把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”(human metagenome)。 人类宏基因组学(human metagenomics)研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。 人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能 宏基因组的研究步骤 分离特定环境生物DNA 纯化大分子量DNA进行克隆 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系 对宏基因组文库的DNA进行分析 样品中DNA的提取和富集 采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法(细胞提取法) 直接裂解法 操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等)和化学法、酶法等 提取方法差别：细胞破壁的方式不同 优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好 缺点：但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1—50 kb) )且多为平端，不利于建库，同时难以完全去除酚类物质 间接提取法 操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。 优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高 缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位裂解法少10—100倍 载体选择 克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等 大肠杆菌，链霉菌和假单胞菌 大片段插入载体、表达载体、穿梭载体 Comparison of different clone vectors 宏基因组文库的建立 宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目