蛋白质结晶.docxVIP

1.3 结晶方法(Crystallization Techniques) 1.3.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 1.3.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc′?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。 1.3.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion） 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图4给出了沉滴法的简图。 1.3.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如图1.5a）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约10min。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Zeppezauer method）或者树脂玻璃纽扣（如图1.5b）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。 另一中微透析方法在图1.6中有描述，将5μl蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Eppendorf管中。 蛋白质结晶系列之一（自译） 已有 1971 次阅读 2008-11-10 22:11 |个人分类:/home.php?mod=spaceuid=200233do=blogclassid=100500view=me科研 1. 蛋白质结晶（Crystallizing a Protein）1.1 引言（Introduction）当别人在谈论傅立叶和帕特森，或者分子置换及分子动力学改良时，新到蛋白质X射线晶体学实验室的同学们可能会迷惑。然而，他们立即会明白要想确定蛋白质的结构，首先必须生长出合适的晶体。没有晶体，便谈不上用X射线确定蛋白质结构。这一章，我们讨论蛋白质晶体生长的原理。作为实践，我们将给出结晶溶菌酶的方法。我们还将得到一个溶菌酶晶体的X射线衍射图像，这将提供对X射线衍射的简介。这一章包括一个关于常见问题的讨论。??1.2 蛋白质结晶原理（Principles of Protein Crystallization）蛋白质的X射线结构分析首先要获得合适的单晶。蛋白质结晶学尚未发展成熟，尽管很受人亲睐，特别是受航天飞机中微重力实验 (Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995) 的激发。蛋白质结晶是一个反复试验的过程，蛋白质逐渐会从溶液中析出，杂质、晶核及其他未知因素对此过程有所影响。通常，蛋白质越纯，生长晶体几率越大。蛋白质结晶学者对蛋白质的纯度要求要严于生化学家的